Шановні колеги, вітаю Вас! Інформую Вас про те, що 1-го червня 2021 р. (вівторок) в рамках загальноінститутського наукового семінару «Актуальні проблеми сучасної біохімії» в Актовій залі Інституту відбудеться розширене засідання колективу відділу біохімії м’язів із залученням співробітників відділу молекулярної біології для заслуховування та аналізу дисертаційної роботи м.н.с. відділу молекулярної біології Лузіної Ольги Ярославівни. Тема доповіді – «Роль IRE1 в експресії NAMPT та залежних від нього протеїнів у клітинах гліоми». Файл із тезами доповіді додається до цього листа. Науковий керівник дисертантки – чл.-кор. НАН України професор О.Г. Мінченко. Запрошуємо до участі у роботі семінару усіх бажаючих.
Увага! Участь у роботі семінару можлива виключно за умов користування захисними масками та взаємодистанційного перебування слухачів у залі. Дякую за розуміння !
ТЕЗИ
«Роль IRE1 в експресії NAMPT та залежних від нього протеїнів
у клітинах гліоми»
Доповідач: Лузіна Ольга Ярославівна, молодший науковий співробітник відділу молекулярної біології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.
Науковий керівник: Мінченко Олександр Григорович, доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАН України.
Актуальність теми: Злоякісна трансформація є багатостадійним процесом, що супроводжується поступовим набуттям клітинами онкогенних властивостей, таких як резистентність до апоптозу, посилена проліферація, репрограмування тотального метаболізму з метою адаптації пухлин до гіпоксії та дефіциту поживних речовин. Водночас, для виживання та протидії стресовим чинникам, в пухлині активується мережа внутрішньоклітинних сигнальних каскадів, спрямована на посилення ангіогенезу та процесів проліферації. Ключовий сигнальний шлях стресу ендоплазматичного ретикулума опосередкований протеїном IRE1 та є важливим модулятором пухлинного росту. Раніше на моделі ембріонів курчат було показано, що в клітинах гліоми U87 з блокадою кіназної та ендорибонуклеазної функціональної активності IRE1 спостерігаються виражені протипухлинні ефекти. Проте молекулярні механізми IRE1-опосередкованого пригнічення росту пухлин до кінця не з’ясовані і потребують детального вивчення.
Плейотропний ензим NAMPT (фосфорибозилтрансфераза нікотинаміду), відомий під назвою вісфатин та PBEFє ключовим фактором стабільності геному, регулятором транскрипції, трансляції, клітинної сигналізації та метаболізму. В середині клітини NAMPT лімітує синтез NAD, потужного регулятора енергетичного балансу клітини. Гіперекспресія NAMPT спостерігається в багатьох типах пухлин, а фармакологічне пригнічення даного ензиму знижує проліферацію, міграцію та інвазію, а також сприяє апоптозу. Оскільки NAMPT відіграє важливу роль у процесах проліферації як в нормі, так і за канцерогенезу, можна припустити, що даний ензим задіяний у регуляції росту гліоми та пригніченні проліферації за умови блокади активності сенсорно-сигнального протеїну IRE1. Отже, з метою глибшого розуміння механізмів пухлинного росту ми обрали в якості таргетного онкопротеїну NAMPT для вивчення його ролі в системі IRE1 сигнального шляху стресу ендоплазматичного ретикулума, а також у репрограмуванні геному в клітинах гліоми.
Мета: виявлення міжгенних взаємодій у клітинах гліоми шляхом дослідження експресії генів за умов сайленсінгу мРНК NAMPT та пригнічення сигнального протеїну IRE1 для розкриття механізмів пухлинного росту.
Методи дослідження: культивування клітин гліоми лінії U87 та її субліній, сайленсінг мРНК, виділення тотальної РНК із культури клітин, спектрофотометричне визначення кількості РНК та її спектральних характеристик, електрофорез нуклеїнових кислот, синтез комплементарних ДНК методом зворотної транскрипції, полімеразна ланцюгова реакція, в тому числі кількісна полімеразна ланцюгова реакція для оцінки відносного рівня експресії генів на рівні мРНК, спектрофотометричне визначення кількості протеїнів, електрофорез протеїнів у поліакриламідному гелі, аналіз протеїнів методом імуноблотингу, комп’ютерний аналіз результатів, отриманих за допомогою кількісної полімеразної ланцюгової реакції, статистичні методи обробки отриманих даних.
Результати: Вперше було показано, що у клітинах гліоми лінії U87 з пригніченою активністю протеїнкінази та ендорибонуклеази або лише ендорибонуклеази сенсорно-сигнального протеїну IRE1 спостерігається різке зниження рівня експресії про-проліферативного гена NAMPT у порівнянні з контрольними клітинами, що свідчить про опосередкованість цих змін саме ендорибонуклеазою IRE1 та може відігравати певну роль у контролі процесів проліферації клітин гліоми.
Виявлено, що пригнічення IRE1 підвищує експресію miR-182, сайти зв’язування з якою були виявлені на 3’-кінцевій нетранслюючій послідовності мРНК NAMPT. Таким чином, IRE-залежна регуляція експресії мРНК NAMPT може здійснюватися на пост-транскрипційному рівні та опосередковуватись активацією мікроРНК miR-182.
Встановлено, що пригнічення функціональної активності сенсорно-сигнального протеїну IRE1 впливає на експресію більшості досліджених генів у клітинах гліоми лінії U87, а за сайленсінгу мРНК NAMPT зафіксовані протилежно спрямовані зміни експресії даних генів. Показано, що у клітинах гліоми за умов пригнічення IRE1 знижується експресія онкогенів ATF6, BIRC5, GLO1, RAB5C, COL6A1 і TGM2 тоді як за умов пригнічення NAMPT рівень експресії цих генів підвищується. Продемонстровано зниження експресії ATF3 та DEK за умов пригнічення мРНК NAMPT та блокади функціональної активності IRE1, що свідчить про можливу причетність їх до активації анти-проліферативних механізмів в клітинах гліоми.
Показано, що пригнічення функціональної активності IRE1 по-різному модифікує чутливість експресії більшості досліджених генів до умов гіпоксії в клітинах гліоми, а це є важливим фактором пухлинного росту.
Виявлено, що блокада активності IRE1 модифікує вплив дефіциту глутаміну на рівень експресії більшості досліджених генів, а це є одним з механізмів IRE1-опосередкованого пригнічення проліферації клітин гліоми.
Отримані результати вказують на важливу роль протеїну NAMPT і сенсорно-сигнального протеїну IRE1 у репрограмуванні геному в клітинах гліоми, а також у регуляції експресії пухлино-залежних генів, задіяних у контролі процесів проліферації, апоптозу, інвазії та метастазування.
Практичне значення отриманих результатів полягає в тому, що детальне вивчення молекулярних механізмів міжгенної взаємодії в процесі репрограмування геному за умов зміни рівня експресії NAMPT чи активності IRE1 у гліомах є необхідним для оцінки та прогнозування наслідків таргетної терапії та дозволяє ідентифікувати потенційні мішені для подальших досліджень і розробки нових підходів до протипухлинної терапії.