Шановні колеги, вітаю Вас! Науковий семінар Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України «Актуальні питання сучасної біохімії» продовжує свою роботу. 13-го жовтня (вівторок) в Актовій залі о 10-30 будемо слухати доповідь м.н.с відділу структури та функції білка Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, аспіранта кафедри біохімії ННЦ «Інститут біології та медицини» Київського національного університету імені Тараса Шевченка Стогнія Євгенія Миколайовича.
Доповідь буде зроблено за матеріалами кандидатської дисертації, яку планується подати до захисту до Спецради Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна.
Як завжди, до цього листа додаються авторські тези доповіді.
Запрошуємо Вас та Ваших колег до участі у роботі нашого семінару.
Увага! Участь у роботі семінару можлива виключно за умов користування захисними масками та взаємодистанційного перебування слухачів в залі. Дякуємо за розуміння!
З повагою – С.О.Костерін.
Спрямований протеоліз αС-регіону фібриногену
Стогній Євгеній Миколайович, м.н.с відділу структури та функції білка інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, аспірант кафедри біохімії ННЦ «Інститут біології та медицини» Київського національного університету імені Тараса Шевченка.
Актуальність теми. Вивчення структури та функції фібриногену є ключем для контролю за зсіданням крові та фібринолізом, а також до модуляції численних фізіологічних процесів, опосередкованих фібриногеном. αС-регіони фібриногену є структурно лабільними та реакційно здатними частинами молекули, вивчення яких має важливе значення, адже ці ділянки беруть участь і у тромбоутворенні, і у взаємодії з клітинами під час загоєння ран, проліферації та метастазуванні ракових клітин тощо. У роботі вивчали функції окремих ділянок αС-регіонів за допомогою спрямованого протеолізу вивсокоселективними протеїназами.
Мета і задачі дослідження. Метою роботи був спрямований протеоліз фібрин(оген)у для вивчення ролі окремих ділянок αС-регіонів в полімеризації фібрину, агрегації тромбоцитів та підтримці життєздатності ендотеліоцитів
Для досягнення мети було поставлено такі завдання:
- Провести скринінг протеїназ різного походження, специфічних до αС-регіонів фібрин(оген)у.
- Охарактеризувати специфічність та визначити місця гідролітичної дії протеїназ на молекулу фібриногену.
- Розробити спосіб ковалентної прошивки αС-регіонів фібрину.
- Шляхом спрямованого протеолізу фібрин(оген)у протеїназами отримати форми фібриногену, повністю або частково позбавлені αС-регіонів.
- З використанням отриманих форм фібриногену дослідити роль окремих ділянок αС-регіонів у полімеризації фібрину, агрегації тромбоцитів та проліферації ендотеліоцитів.
Методи дослідження. гель-електрофорез в системі Лемлі; ензим-електрофорез; вестерн-блот; інгібіторний аналіз; визначення субстратної специфічності ензимів; хроматографія, що розділяє за розміром; MALDI-TOF мас-спектрометрія; турбідиметрія; електронна мікроскопія; агрегатометрія; МТТ-тест.
Результати. Скринінг ензимів, отриманих із низки біологічних рідин, дозволив обрати протеїнази з культурального середовища Bacillus thuringiensis вар. israelensis IMV B-7465 та з отрути Gloydius halys halys як придатні інструменти для отримання форм фібриногену, позбавлених фрагментів αС-регіону Аα505-610 та Аα414-610 відповідно.
Використання отриманих частково гідролізованих форм фібриногену дозволило встановити, що фрагмент доменної частини αС-регіону фібрин(оген)у Aα505-610, але не Aα414-610, залучений до процесу побудови протофібрил фібрину. Водночас, взаємодії, опосередковані фрагментом αС-регіону Aα414-504, забезпечують зв’язування фібрин(оген)у з рецепторами тромбоцитів, імовірно завдяки ділянкам Asp-Gly-His (Аα454-456) та Lys-Gly-Asp (Аα418-420). Натомість фрагменти αС-регіону Aα505-610 важливі для ефективного росту ендотеліоцитів на фібриновій матриці, імовірно завдяки ділянці Arg-Gly-Asp (Аα572-574).
Таким чином, у дисертаційній роботі вперше розмежовано функціональну роль окремих ділянок доменної частини αС-регіону молекули фібрин(оген)у в процесах полімеризації фібрину, агрегації тромбоцитів та проліферації ендотеліоцитів.
У ході роботи також розроблено спосіб отримання ковалентно прошитих αС-вмісних олігомерів шляхом плазмінового гідролізу фібрину, стабілізованого бактеріальною трасглутаміназою, який буде використано у подальших дослідженнях ролі окремих ділянок молекули фібрину у протеїно-клітинних взаємодіях.