Оберіть свою мову

Телефонний довідник

 
 

GoogleTranslate

Ukrainian Bulgarian Czech Danish English Estonian Finnish French German Greek Hungarian Italian Japanese Latvian Lithuanian Norwegian Polish Portuguese Romanian Slovak Slovenian Spanish Turkish
 

Шановні колеги! Науковий семінар Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України «Актуальні проблеми сучасної біохімії» продовжує свою діяльність. 11-го червня (вівторок) 2019 р. о 10-30 в Актовій залі Інституту будемо слухати доповідь ст. наук. співр. відділу біохімії м’язів ІБХ НАН України ВЕКЛІЧ  Тетяни Олександрівни «КАЛІКС[4]АРЕНИ ЯК СЕЛЕКТИВНІ ТА АФІННІ ІНГІБІТОРИ Mg2+,ATP-ЗАЛЕЖНИХ КАТІОН-ТРАНСПОРТУВАЛЬНИХ ЕЛЕКТРОЕНЗИМІВ ГЛАДЕНЬКОМ’ЯЗОВИХ КЛІТИН». Як завжди, до інформаційного листа додаємо авторські тези доповіді. Запрошуємо Вас та Ваших колег до участі у роботі семінару.

З повагою – С.О.Костерін

 

ТЕЗИ НАУКОВОЇ ДОПОВІДІ

«КАЛІКС[4]АРЕНИ ЯК СЕЛЕКТИВНІ ТА АФІННІ ІНГІБІТОРИ Mg2+,ATP-ЗАЛЕЖНИХ

КАТІОН-ТРАНСПОРТУВАЛЬНИХ ЕЛЕКТРОЕНЗИМІВ

ГЛАДЕНЬКОМ’ЯЗОВИХ КЛІТИН»

В Е К Л І Ч  Тетяна Олександрівна,

с.н.с. відділу біохімії м’язів ІБХ ім. О.В. Палладіна НАН України

 

 Іон кальцію є важливим внутрішньоклітинним месенджером, і саме під контролем Са2+-залежних сигнальних шляхів реалізуються більшість біохімічних та фізіологічних процесів: скорочення м’язів (скелетних, гладеньких, міокарду), запліднення, проліферація, секреція, нейротрансмісія, клітинний ріст, а також апоптоз та некроз. Гладенькі м`язи відіграють важливу роль у забезпеченні  функціонування внутрішніх органів та систем органів. Для здійснення процесів скорочення-розслаблення гладеньких м`язів, зокрема, міометрія, необхідно, щоб рівень цитоплазматичного Са2+ у міоплазмі динамічно та оборотно змінювався в діапазоні концентрацій від наближено 100 нМ (стан спокою, релаксація механічної напруги) до 1 мкМ (скорочення). Порушення Са2+-залежної скоротливої функції міометрія у жінок часто стає причиною різноманітних патологій: слабкості пологової діяльності, спонтанних абортів, передчасних пологів, викидней, атонії, гіпо- і гіпертонусу матки. Проте, незважаючи на значну кількість експериментальних біохімічних та біофізичних робіт, присвячених дослідженню внутрішньоклітинних кальцієвих сигналів в міометрії, маємо вельми обмежені дані щодо механізмів підтримання фізіологічно значущої концентрації іонів Са та її спрямованої регуляції у міоцитах матки в нормі та за патологічних станів.

Важливу роль у забезпеченні контроля скорочення - розслаблення м’язових клітин, у тому числі гладеньком’язових, відіграють мембранозв’язані Mg2+,АТР-залежні Са2+-транспортувальні та Na+,K+-транспортувальні електроензими – електрогенні іонні помпи.

Активність електрогенних транспортних систем залежить не тільки від  концентрації  іонів та субстрату, але і від мембранного потенціалу та стехіометрії іонного обміну. Відповідно, транспортна АТРаза, яка генерує електричний струм і активність якої змінюється в залежності від мембранного потенціалу, є електроензимом. Тому актуальним є пошук сполук, які були б селективними та достатньо афінними ефекторами цих помп, що здатні модифікувати Са2+-залежну скоротливу функцію міометрія у випадку її порушення за вищезазначених патологічних станів і водночас були б нетоксичними для організму. У цьому аспекті, зокрема, являють інтерес каліксарени – чашоподібні макроциклічні сполуки, які одержують шляхом циклоконденсації пара-заміщених фенолів і формальдегіду. Попередні літературні дані вказували на те, що вибрані калікс[4]арени можуть утворювати комплекси з АТР, але на час початку виконання цієї роботи були відсутні результати щодо використання зазначених сполук як ефекторів катіон-залежного ензиматичного та неензиматичного гідролізу цього нуклеозидтрифосфату.

Мета наукової доповіді – представити, систематизувати та проаналізувати власні експериментальні результати щодо біохімічних та фізико-хімічних механізмів дії калікс[4]аренів на електроензими - катіон-транспортувальні АТР-гідролазні системи гладеньком’язових клітин матки, а також на неензиматичний гідроліз АТР.

При виконанні досліджень були використані методи препаративної та  аналітичної біохімії, біохімічної мембранології, ензимології, спектрофотометрії, спектрофлуориметрії, протокової цитофлуориметрії, лазерної-кореляційної спектроскопії, світлової та електронної мікроскопії, конфокальної мікроскопії, кондуктометрії, тензометрії, комп`ютерного моделювання, молекулярної динаміки та докінг-аналізу, хімічної та біохімічної кінетики, математичного моделювання, а також статистичного аналізу. Калікс[4]арени були синтезовані та охарактеризовані методами ЯМР та інфрачервоної спектроскопії під керівництвом акад. НАН України В.І.Кальченка (ІОХ НАН України).

У доповіді буде акцентовано увагу на наступних експериментальних даних.

Вперше наведено докази використання калікс[4]аренових платформ як ефективних регуляторів активності електроензимів мембран клітин гладенького м’язу матки - Mg2+,АТР-залежної Са2+-помпи та Na+,K+-помпи.

Mg2+,АТР-залежна Са2+-транспортувальна помпа плазматичної мембрани та калікс[4]арени. Ця помпа безпосередньо використовує енергію гідролізу АТР для електрогенного викиду іонів Са з цитоплазми у позаклітинний простір. Із залученням методу лазерної-кореляційної спектроскопії було встановлено, що калікс[4]арен С-107 взаємодіє з везикулами плазматичних мембран міоцитів міометрія і викликає агрегацію мембранних везикул між собою або з мікрочастинками калікс[4]арену. Продемонстровано, що калікс[4]арен С-107 може вбудовуватись в плазматичну мембрану і проникати через неї. Вперше показано, що калікс[4]арен С-90 селективно (не впливає на активність інших АТР-гідролаз на рівні плазматичної мембрани) дозозалежно інгібує активність транспортувальної Са2+,Mg2+-АТРази і препарату очищеної солюбілізованої Са2+,Mg2+-АТРази, коефіцієнти інгібування І0,5 складають 20,2 ± 0,5 і 34,6 ± 6,4 мкМ відповідно. Структурний фрагмент калікс[4]арену С-150 (суто «калікс[4]аренова чаша») та модельна сполука М-1 (у складі молекули калікс[4]арену С-90 маємо 4 фрагменти М-1) незначно пригнічують Са2+,Mg2+-АТРазну активність плазматичних мембран. Ефективність інгібування Са2+,Mg2+-АТРази калікс[4]аренами залежить від кількості та взаємного розташування фенілсульфониламідинових груп на верхньому вінці «калікс[4]аренової чаші». Модифікація нижнього вінця калікс[4]аренової «чаші» двома октанольними залишками (калікс[4]арен С-956) на додаток до двох залишків пропанолу (калікс[4]арен С-90) призводить до збільшення ефективності інгібування активності Са2+,Mg2+-АТРази плазматичної мембрани. Доведено, що калікс[4]арен С-90 діє як повний неконкурентний інгібітор Са2+,Mg2+-АТРази плазматичної мембрани, так як він не впливає на коефіцієнти активації для іонів Са та Mg, уявну константу Міхаеліса Кm за АТР, але у всіх випадках дозозалежно зменшує максимальну початкову швидкість Vmax реакції гідролізу АТР.

Із використанням методу Са2+-чутливої спектрофлуориметрії було встановлено, що під дією калік[4]арену С-90 пригнічується Mg2+,АТР-залежна акумуляція іонів Са у везикулах плазматичних мембран міоцитів матки. Результати математичного моделювання передбачили, що за цих умов калікс[4]арен С-90 має збільшувати концентрацію Са2+ в незбуджених міоцитах, що й було підтверджено експериментально з використанням методу Са2+-чутливої флуоресцентної конфокальної мікроскопії. За допомогою методу лазерної-кореляційної спектроскопії  показано, що калік[4]арен С-90 зменшує гідродинамічний діаметр міоцитів міометрія.

У співпраці з к.б.н. О.В.Цимбалюк (ІВТ КНУ імені Тараса Шевченка) було встановлено, що калікс[4]арен С-90 на 20 % пригнічує швидкість релаксації м`язевого скорочення, нормованну на амплітуду скоротливої відповіді (у випадку реєстрації спонтанної активності смужок міометрія). Ця сполука також збільшує швидкість скорочення міометрія у відповідь на стимуляцію цього процесу утеротоніком окситоцином. Ці дані цілком знаходяться у відповідності з вищенаведеними біохімічними результатами.

Отже, нами знайдено селективний (на рівні плазматичної мембрани) низькомолекулярний вельми афінний (І0,5 = 20 – 30 мкМ) інгібітор Mg2+,АТР-залежного Са2+-транспортувального електроензиму - калікс[4]арен С-90.

Як виявилося, калікс[4]арен С-90 з меншою ефективністю пригнічує також активність Са2+-помпи саркоплазматичного ретикулуму (І0,5 = 56 мкМ), ніж активність Са2+-помпи Са2+,Mg2+-АТРази плазматичної мембрани (І0,5 = 20 мкМ). Втім, в нещодавних дослідах ми продемонстрували, що новий тіакалікс[4]арен С-1087 – близький аналог калікс[4]арену С-90, також селективно (як і С-90), але значно більш ефективно гальмує Mg2+,АТР-залежний Са2+-транспортувальний електроензим плазматичної мембрани, проте суттєво слабкіше (ніж С-90) пригнічує активність Са2+-помпи ретикулуму.  

Mg2+,АТР-залежна Na+,K+-транспортувальна помпа плазматичної мембрани та калікс[4]арени. Ця помпа безпосередньо використовує енергію гідролізу АТР для здійснення трансмембранного 3Na+-2K+ електрогенного обміну одновалентних катіонів; у свою чергу енергія натрієвого градієту використовується для забезпечення активного Na+-залежного антипортного транспорту іонів Са (Na+-Ca2+ обмін). Вперше встановлено, що калікс[4]арени С-97, С-99 та С-107 селективно та значно ефективніше ніж уабаїн, пригнічують активність Mg2+,АТР-залежного Na+,K+-транспортувального електроензиму - Na+,K+-АТРази (значення уявних коефіцієнтів інгібування становить 33+4 нМ, 98+8 нМ, 54+6 нМ та 21+5 мкМ відповідно для  калікс[4]аренів С-97, С-99, С-107 та уабаїну). Детально вивчено кінетичні властивості дії зазначених калікс[4]аренів на активність натрієвої помпи. Було доведено, що ефективність інгібування цього ензиму під дією калікс[4]аренів залежить від взаємного розташування амінофосфонових групп та від модифікації верхнього та нижнього вінця молекули калікс[4]арену. Калікс[4]арени С-97 та С-107  не впливають на коефіцієнт активації для іонів Mg, уявну константу Міхаеліса Кm за АТР, але зменшують спорідненість Na+,K+-АТРази до іонів Na.

Неензиматичний гідроліз АТР та калікс[4]арени. Показано, що деякі калік[4]арени (С-107, С-91 та С-106) можуть стимулювати неензиматичний гідроліз АТР, який протікає вельми повільно, характеризується низькою спорідненістю калікс[4]аренів до АТР та складною кінетикою реакції гідролізу: крива цього процесу не підпорядковується закономірностям реакцій низьких порядків (нульового, першого) і є негіперболічною (у часі). Детально вивчено кінетичні та каталітичні властивості реакції неензиматичного калікс[4]ареніндукованого гідролізу АТР (на прикладі калік[4]арену С-107). З одержаних даних однозначно випливає, що причиною ефективної інгібуючої дії досліджених калікс[4]аренів на активність транспортувальних електроензимів (див. вище) не може бути тривіальне утворення комплексу «калікс[4]арен-АТР».

Висновок. У науково-теоретичному (фундаментальному) аспекті одержані результати є суттєвими для розуміння біохімічних та фізико-хімічних властивостей транспортувальних електроензимів - Са2+- та Na+,K+-транспортувальних Mg2+,АТРазних систем плазматичної мембрани і саркоплазматичного ретикулуму гладеньком’язових клітин, та механізмів спрямованої регуляції функціональної активності цих систем. Вони поглиблюють відомості стосовно іонних, молекулярних та мембранних механізмів внутрішньоклітинного кальцієвого обміну в гладеньких м’язах, зокрема, щодо ролі плазматичної мембрани у забезпеченні електро- та фармакомеханічного спряження в них. В практичному аспекті одержані результати свідчать на користь того, що вибрані калікс[4]арени можуть бути успішно використані в лабораторній практиці як селективні афінні інгібітори Mg2+,АТР-залежних катіон-транспортувальних електроензимів при вивченні однієї з нагальних проблем біохімії, біофізики та клітинної біології – з’ясуванні мембранних механізмів внутрішньоклітинної кальцієвої сигналізації. Наші результати, як ми вважаємо, також можуть бути корисними для  розбудови нових фармакологічних препаратів - нетоксичних низькомолекулярних високоафінних та селективних регуляторів функціональної активності катіон-транспортувальних електроензимів гладеньких м’язів. З урахуванням низької токсичності калікс[4]арену С-90 та його аналогів можна стверджувати, що вони є перспективними для клінічної практики у якості препаратів для підсилення окситоцин-стимульованих пологів під час їх ускладнень, а також для підвищення базального тонусу міометрія.