Оберіть свою мову

Телефонний довідник

 
 

GoogleTranslate

Ukrainian Bulgarian Czech Danish English Estonian Finnish French German Greek Hungarian Italian Japanese Latvian Lithuanian Norwegian Polish Portuguese Romanian Slovak Slovenian Spanish Turkish
 

Шановні колеги! Науковий семінар «Актуальні проблеми сучасної біохімії» Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України продовжує свою діяльність.

27-го лютого (вівторок) о 10-30 в Актовій залі Інституту будемо слухати доповідь м.н.с. відділу біохімії вітамінів і коензимів Мазанової Анни Олександрівни (Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам необхідно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.)  «Розробка імуноензимної тест-системи для визначення 25OHD як маркера забезпеченості організму вітаміном D за цукрового діабету». Мова йде за апробацію кандидатської дисертації. До цього листа, як завжди, додаємо файл із авторськими тезами доповіді.

Запрошую Вас та Ваших колег до участі у роботі нашого семінару.

З повагою – С.О.Костерін.

 

Розробка імуноензимної тест-системи для визначення 25OHD як маркера забезпеченості організму вітаміном D за цукрового діабету

Мазанова Анна Олександрівна, м.н.с., Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам необхідно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

Актуальність: Упродовж останніх 20 років спостерігається значний прогрес у розумінні метаболізму та механізмів сигналювання вітаміну D. Вітаміни групи D (D3 та D2) наразі розглядають не лише як регулятори процесів кісткового ремоделювання, але і як сполуки, що впливають на проліферацію та диференціювання клітин, ангіогенез і апоптоз. Вітамін D-дефіцитний стан асоціюють з розвитком низки патологічних станів, серцево-судинних, онкологічних та автоімунних захворювань, передусім цукрового діабету 1 типу (ЦД 1). Саме тому характеристика вітамін D-статусу організму є важливим діагностичним параметром у сучасній клінічній практиці. На сьогодні на ринку наявний ряд методів, що дозволяють вимірювати вміст 25OHD (головного маркера забезпеченості організму вітаміном D) у серологічних зразках. До цих методів належать: a) високоефективна рідинна хроматографія у поєднанні з масспектометрією (HPLC, LC/MS); б) радіоконкурентний/імунний аналіз (RIA); в) імуноензимний аналіз (ELISA). Більшість з цих методів є складними у виконанні, потребують великих об’ємів зразка та дорогого обладнання (HPLC) або передбачають роботу зі шкідливими речовинами (RIA). Натомість ELISA-формат дозволяє швидко та безпечно робити визначення одночасно у 50-60 зразках. Наявні на ринку комерційні системи для визначення 25OHD є занадто дорогими. Враховуючи це, метою роботи була: розробка та конструювання імуноензимного вітчизняного діагностикуму для визначення рівня 25ОНD  у сироватці крові за умов розвитку цукрового діабету 1 типу. Для досягнення мети було поставлено ряд завдань:

  1. Синтез імуногенних кон’югатів похідних 25ОНD3, що містили активну карбоксильну групу, з протеїнами-носіями - гемоціаніном молюсків (KLH) та альбуміном курячого яйця (OVA), імунізації кролів та характеристика отриманих поліклональних антисироваток методом непрямого ELISA;
  2. Конструювання імуноензимної тест-системи для визначення 25OHD у серологічних зразках та подальша розробка методу візуалізації сигналу з використанням біотин-стрептавідинової системи. Відпрацювання схеми постановки реакції та оптимізація умов сорбції антитіл на поверхні полістиролових планшетів, дослідження різних режимів проведення реакції конкуренції та проведення валідації створеної тест-системи за рядом стандартних характеристик;
  3. З’ясування ролі вітаміну D3 у регулюванні експресії 25ОНD3-1α-гідроксилази (CYP27B1) та рецепторів вітаміну D3 (VDR) за стрептозотоцин (STZ)- індукованого цукрового діабету 1типу.

Результати: В роботі вперше було продемонстровано синтез кон’югатів 25OHD3 з KLH та OVA з використанням модифікованого карбодиімідного методу. Було проведено очищення створених кон’югатів методом гель фільтрації та визначено співвідношення молекул гаптену до протеїну-носія за допомогою тонкошарової хроматографії. Застосування кон’югата 25OHD3-KHL дало змогу отримати поліклональні кролячі антитіла проти 25OHD, які було очищено та охарактеризовано за допомогою непрямого імуноензимного аналізу. Було показано, що титр специфічних антитіл знаходився в межах 1:1000-1:10000, антитіла не втрачали своєї активності та специфічності після процедур преципітації за допомогою сульфату амонію та діалізу. Було вперше сконструйовано вітчизняну імуноензимну тест-систему для визначення 25OHD у сироватці крові з біотин-стрептавідиновим конкурентним способом візуалізації сигналу та проведено її валідацію за рядом стандартних характеристик: побудовано стандартну калібрувальну криву, визначено ліміт детектування, кількісний ліміт та коефіцієнти варіативності (внутрішньосистемний - Inter CV і міжсистемний - Intra CV). Проведено тестування «матричного ефекту» гемоглобіну, білірубіну і тригліцеридів та показано, що за умов використання негемолізованих зразків дані сполуки не чинять інгібувального впливу на проведення процедури аналізу. Було встановлено, що перехресна реактивність системи з іншими метаболітами вітаміну D лежить у межах 10%. Продемонстровано зміни синтезу ключових елементів вітамін D- ендокринної системи (вміст мРНК і протеїну VDR та CYP27B1) у печінці, нирках, кістковій тканині і кістковому мозку за ЦД 1 та встановлено доцільність використання вітаміну D3, як засобу корекції діабет-індукованих порушень у синтезі вітамін D рецепторів та 25OH3-1α гідроксилази у досліджуваних тканинах.