Шановні колеги, вітаю Вас! Науковий семінар Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України «Актуальні проблеми сучасної біохімії» продовжує свою роботу. 7 червня 2016 р. (вівторок) о 10-30 в Актовій залі Інституту будемо слухати доповідь м.н.с. відділу молекулярної біології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України Цимбал Дарії Олександрівни, тема доповіді: «РОЛЬ СИГНАЛЬНОГО ЕНЗИМУ IRE1 У РЕГУЛЯЦІЇ ЕКСПРЕСІЇ ПРО- ТА АНТИ-ПРОЛІФЕРАТИВНИХ ГЕНІВ У КЛІТИНАХ ГЛІОМИ». МОВА ЙДЕ ЗА АПРОБАЦІЮ КАНДИДАТСЬКОЇ ДИСЕРТАЦІЇ. Авторські тези доповіді, як завжди, додаються. Запрошуємо Вас та Ваших колег до участі у роботі нашого семінару.
З повагою – С.О.Костерін.
РОль СИГНАЛЬНОГО ЕНЗИМУ IRE1 У РЕГУЛЯЦІЇ ЕкспресіЇ ПРО- ТА АНТИ-ПРОЛІФЕРАТИВНИХ генів у клітинах гліоми
Доповідач: Цимбал Дарія Олександрівна, молодший науковий співробітник відділу молекулярної біології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.
Науковий керівник: Мінченко Олександр Григорович, доктор біологічних наук, професор.
Актуальність теми. Гліоми — пухлини центральної нервової системи, що виникають за злоякісного переродження клітин глії, є одними з найбільш агресивних злоякісних новоутворень.
Було показано, що конститутивна активація сенсорно-сигнальних шляхів стресу ендоплазматичного ретикулуму, зокрема біфункціонального ензиму IRE1/ERN1, є необхідною для виживання клітин гліоми.
На сьогоднішній день інгібітори сенсорно-сигнальний ензиму IRE1/ERN1 розглядаються як потенційні хіміотерапевтичні агенти. З огляду на це,молекулярні механізми, за якими IRE1/ERN1 здійснює контроль над процесами проліферації клітин гліоми привертають особливу увагу.
Важливу роль у регуляції проліферативних процесів відіграють транскрипційні фактори та пухлинні супресори, дерегуляція їх експресії зафіксована майже у всіх типах злоякісних новоутворень.
Таким чином, вивчення експресії генів транскрипційних факторів та пухлинних супресорів у клітинах гліоми з пригніченою функцією IRE1/ERN1-залежної гілки сигнального шляху стресу ендоплазматичного ретикулуму, а також за умов гіпоксії, дефіциту глюкози та глутаміну, є необхідним для з'ясування їх участі у контролі процесів проліферації пухлинних клітин, а також ідентифікації нових потенційних мішеней протипухлинної терапії.
Мета: дослідити експресію генів транскрипційних факторів, пухлинних супресорів та генів, асоційованих з проліферацією і міграцією пухлинних клітин, у клітинах гліоми лінії U87 за умов повного або часткового пригнічення функції IRE1, основного сенсорно-сигнального ензиму стресу ендоплазматичного ретикулуму, а також за умов гіпоксії, дефіциту глюкози та глутаміну у середовищі, для виявлення можливої участі цих генів у IRE1-залежному рості злоякісних пухлин.
Методи дослідження: методи культивування клітин, виділення РНК та екстрактів протеїнів з клітин, спектрофотометричні методи визначення кількості та якості зразків РНК, синтез комплементарних ДНК за допомогою зворотних транскриптаз, методи полімеразної ланцюгової реакції, в тому числі кількісної, електрофоретичний аналіз нуклеїнових кислот, рестрикційний аналіз плазмідних ДНК, методи молекулярного клонування, ліпосомної трансфекції клітин, вестерн-блот аналіз протеїнів, метод люциферазного репортера, методи статистичного аналізу.
Результати: вперше показано, що експресія мРНК генів HOXC6, ATF3, TBX3, TBX2, MAZ, SNAI2/SLUG, TCF3, TCF8, MYBL1, MYBL2, FOXF1, EPAS1, E2F8, MEST, CD24, KRT18, ING1, ING2, IL13RA2 та MYRL2 у клітинах гліоми лінії U87 залежить від функціональної активності сенсорно-сигнального ензиму стресу ендоплазматичного ретикулуму IRE1. Встановлено достовірне зменшення рівня експресії мРНК про-проліферативних транскрипційних факторів за умов пригнічення IRE1. Виявлено зростання рівнів експресії мРНК пухлинних супресорів MEST, KRT18, ING1, ING2 таMYRL2 за умов пригнічення IRE1.
Показано, що регуляція експресії генів HOXC6, ATF3, TBX3, FOXF1, EPAS1, E2F8, MEST, CD24, KRT18, ING2,IL13RA2 та MYRL2 залежить як від кіназної, так і від ендорибонуклеазної активності IRE1.
Було вперше продемонстровано, що пригнічення функції IRE1 модифікує гіпоксичну регуляцію експресії мРНК транскрипційних факторів HOXC6, ATF3, TBX3, FOXF1, EPAS1, E2F8, TCF3, TCF8, SNAI2 та MYBL2, а також пухлинних супресорів ING1, KRT18, CD24 та MESTу клітинах гліоми лінії U87.
Виявлено, що дефіцит глутаміну та глюкози впливає на рівень експресії генів HOXC6, ATF3, FOXF1, TBX3, TBX2, MAZ, SNAI2/SLUG, TCF3, TCF8, EPAS1, E2F8, CD24, KRT18, ING1 у клітинах гліоми лінії U87 в залежності від функції сенсорно-сигнального ензиму IRE1.
Створено мічені на С-кінці с-Myc і 6хHis міткамикДНК-конструкції для експресії домінант-негативної форми IRE1 і його цитозольної частини та проведено аналіз експресії відповідних протеїнів у клітинах недрібноклітинної карциноми легень.
Практичне значення роботи полягає у частковій розшифровці механізму IRE1-опосередкованого пригнічення проліферації клітин гліоми, що полягає у зниженні експресії низки про-проліферативних транскрипційних факторів та у зростанні експресії генів пухлинних супресорів. Проведені дослідження дозволяють встановити, що транскрипційні фактори HOXC6 та TBX2, а також субодиниця А2 рецептора інтерлейкіну 13 є перспективними мішенями для досліджень у галузі пошуку нових препаратів для лікування гліом. Практичне значення мають експресійні кДНК-конструкції, які можуть бути використані для вивчення ролі IRE1-залежної гілки сигнального шляху стресу ендоплазматичного ретикулума у злоякісному рості.