ТРАНСМЕМБРАННИЙ ОБМІН Са2+ В МІТОХОНДРІЯХ МІОМЕТРІЯ ЗА ДІЇ ОКСИДУ АЗОТУ ТА КАЛІКС[4]АРЕНІВ - КОЛОМІЄЦЬ ОКСАНА ВАЛЕРІЇВНА

Повідомлення

про захист дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Захист дисертації відбудеться 25 січня 2016 року о 14 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В.

Палладіна НАН України за адресою: 01030, Київ, вул. Леонтовича, 9.

Прізвище, ім'я, по батькові здобувача – Коломієць Оксана Валеріївна

Посада здобувача і повна назва установи, де він працює – молодший науковий співробітник відділу біохімії м'язів Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України

Назва дисертації – «Трансмембранний обмін Са²⁺ в мітохондріях міометрія за дії оксиду азоту та калікс[4]аренів»

Шифр та назва спеціальності – 03.00.04 – біохімія

Шифр спеціалізованої ради – Д 26.240.01

Назва ВНЗ, наукової установи, її відомче підпорядкування, адреса і телефон – Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України (01601, м. Київ, вул. Леонтовича, 9, тел. (044)234-59-74)

Науковий керівник – Костерін С. О., академік НАН України, доктор біологічних наук, професор, завідувач відділу біохімії м'язів (Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України)

Офіційний опонент – Сибірна Н. О., доктор біологічних наук, професор, завідувач кафедри біохімії (Львівський національний університет імені Івана Франка)

Офіційний опонент – Компанець І. В., кандидат біологічних наук, доцент, доцент кафедри біохімії (Навчально-науковий центр «Інститут біології», Київський національний університет імені Тараса Шевченка)

     НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна

КОЛОМІЄЦЬ ОКСАНА ВАЛЕРІЇВНА

УДК 577.352.4

ТРАНСМЕМБРАННИЙ ОБМІН Са²⁺ В МІТОХОНДРІЯХ МІОМЕТРІЯ ЗА ДІЇ ОКСИДУ АЗОТУ ТА КАЛІКС[4]АРЕНІВ

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2016

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор,

                                       академік НАН України

                                       КОСТЕРІН Сергій Олексійович,

                                       завідувач відділу біохімії м`язів,

                                       заступник директора з наукової роботи

                                       Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

Офіційні опоненти:  

доктор біологічних наук, професор

СИБІРНА Наталія Олександрівна

завідувач кафедри біохімії

Львівського національного університету

імені Івана Франка

кандидат біологічних наук, доцент,

КОМПАНЕЦЬ Ірина Володимирівна

доцент кафедри біохімії

ННЦ «Інститут біології»

Київського національного університету

імені Тараса Шевченка

Захист дисертації відбудеться 25 січня 2016 року о 14 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В.

Палладіна НАН України за адресою: 01030, Київ, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії

ім. О.В.Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9).

       Автореферат дисертації розісланий «__» грудня 2015 р.

Вчений секретар                                              

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук                                                      Карлова Н. П.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Гладенькі м'язи виконують фундаментальну роль у забезпеченні життєдіяльності організму, оскільки їхня скоротлива активність є необхідною для функціонування кровоносних та лімфатичних судин, дихальної системи, шлунково-кишкового тракту, сечостатевої системи, тощо. Матка займає важливе положення серед інших гладеньком'язових органів, що обумовлено тією специфічною функцією, яку вона виконує в організмі при виношуванні плоду та пологах.

Іони Са (Са²⁺) є універсальним вторинним месенжером, який має ключове значення у здійсненні контролю скорочення гладеньких м'язів, оскільки зростання внутрішньоклітинної концентрації Са²⁺ є лімітуючою ланкою у спряженні між збудженням та скороченням міоцитів. Са²⁺-гомеостаз забезпечується узгодженим функціонуванням субклітинних Са²⁺-транспортувальних систем (каналів, помп та обмінників), які обумовлюють транспортування катіону через плазматичну мембрану та мембрани внутрішньоклітинних органел, що виконують функцію депо Са²⁺, а саме саркоплазматичного ретикулума і мітохондрій (МХ) [Santo-Domingo J.etal., 2009; Костюк П.Г. та. ін., 2010].

Порушення Са²⁺-гомеостазу у гладеньком'язових клітинах (ГМК), як правило, є наслідком дисфункції Са²⁺-транспортувальних систем [KosterinS.A. etal., 1994]. Отже, пошук та вивчення біохімічних властивостей ендо- та екзогенних речовин, які б мали змогу спрямовано впливати на активність цих систем в субклітинних структурах ГМК, в тому числі і матки (міометрій), є важливим для їхнього подальшого практичного використання з метою корекції порушень контрактильної функції гладеньких м’язів.

Серед ендогенних сполук – можливих регуляторів Са²⁺-гомеостазу – значну увагу дослідників привертає оксид азоту (NO). Здатністьрозслабляти гладенькі м’язи зумовлює інтерес до використання донорів цієї сполуки в акушерсько-гінекологічній практиці. Але шляхи реалізації функціональної активності NOв матці вивчено недостатньо, що є актуальною науковою проблемою. Біохімічною основою міорелаксуючого ефекту NOможе бути його безпосередній вплив на субклітинні системи транспортування Са²⁺ в міоциті, наслідком чого є зниження концентрації катіону в міоплазмі і гальмування Са²⁺-залежної скоротливої активності міометрія [Garfield R.E.etal., 1998;Данилович Ю.В., 2001; Buxton I.L., 2004; Ковалев И.В. и пр., 2004; Данилович Ю.В., 2012].

Поряд з дослідженнями біохімічних властивостей ендогенних регуляторів транспортування Са²⁺ в ГМК важливим є пошук низькомолекулярних малотоксичних і селективних щодо певних катіон-транспортувальних систем екзогенних сполук з метою їхнього подальшого застосування як фармакологічних агентів. Протягом останніх років активну увагу дослідників привертають калікс[4]арени – циклічні олігомери фенолу, які володіють широким спектром біологічної активності та мають низьку токсичність. Важливо, що деякі калікс[4]арени виступають ефективними модуляторами субклітинних катіон-транспортувальних протеїнів міоцитів матки [Лабинцева Р.Д. та ін., 2007; Бевза О.В. та ін., 2013; Veklichetal., 2014]. Зазначені речовини є перспективними щодо подальшого дослідження їхнього впливу на Са²⁺-транспортувальні системи ГМК [Шликов С.Г. та ін., 2007; Лабинцева Р.Д. та ін., 2007; Стид Дж.В. и пр., 2007; Атамась Л.І. та ін., 2009].

МХ відіграють важливу роль в процесах Са²⁺-сигналізації, виконуючи функцію високоефективного Са²⁺-депо, внаслідок їхньої спроможності акумулювати та вивільняти значні кількості цього катіону. Тому МХ здатні впливати на амплітуду та часові характеристикивнутрішньоклітинного Са²⁺-сигналу. Акумуляція Са²⁺ МХ забезпечується передусім функціонуванням Са²⁺-уніпортера внутрішньої мембрани, тоді як зниження концентрації Са²⁺ в матриксі пов’язане із функціонуванням систем Са²⁺/Na⁺- і Са²⁺/Н⁺-обміну [Gunter T.E.etal., 1990; Szabadkai G. etal., 2009; Костюк П.Г. та ін., 2010].

Хоча існують значні досягнення у з'ясуванні біохімічних, біофізичних та функціональних властивостей Са²⁺-уніпортера МХ, інформація щодо його регуляції фізіологічними сполуками та потенційними фармакологічними агентами є доволі обмеженою і стосується, переважно, серцево-судинної системи [Акопова О.В. та ін., 2005; Ghafourifar P.etal., 2005, Santo-Domingo J.etal., 2009; Hoppe U.C., 2010]. Відомості щодо впливу NO на системи трансмембранного обміну Са²⁺ в МХ міометрія в доступній нам літературі відсутні.

Відомо, що вивільнення Са²⁺ з МХ гладеньких м'язів забезпечується Са²⁺/Н⁺-обмінником, функціонування якого передбачається також і в міометрії [Курский М.Д. и пр., 1987]. Не виключено, що модуляторами Са²⁺/Н⁺-обмінника можуть бути калікс[4]арени, оскільки деякі з них впливають на транспорт іонів Са в МХ [Шликов С.Г. та ін., 2007].

Трансмембранний потенціал на внутрішній мітохондріальній мембрані (150 – 170 мВ) є фундаментальною характеристикою МХ, яка визначає їхню функціональну активність і є індикатором останньої [Костюк П.Г. та ін., 2010]. Тому вивчення впливу NOта калікс[4]аренів на цей показник є актуальним.

Отже, дослідження біохімічних властивостей трансмембранного обміну Са²⁺ в МХ (Са²⁺-уніпортер, Са²⁺/Н⁺-обмінник) та впливу на нього ендо- та екзогенних модуляторів (оксид азоту, вибрані калікс[4]арени) є важливим для пошуку специфічних та малотоксичних ефекторів відповідних транспортувальних систем з метою спрямованої регуляції концентрації Са²⁺ в матриксі МХ та в міоплазмі.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами

Дисертація відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу біохімії м’язів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (зав. – академік НАН України, професор, д.б.н. Костерін С.О.), проблема “Біохімія тварин та людини”: - тема № 5, № 0109U001589 “Вивчення біохімічних механізмів регуляції концентрації іонів Са в гладеньком’язових клітинах” (І кв. 2009 - ІV кв. 2013); - тема № 5, № 0114U003213 “Вивчення біохімічних механізмів спряження збудження та скорочення в гладеньком’язових клітинах” (І кв. 2014 - ІV кв. 2018).

Мета роботи: Метою роботи було вивчити трансмембранний обмін Са²⁺ в мітохондріях міометрія щурів та поляризацію їхньої мембрани за дії оксиду азоту та калікс[4]аренів.

Головні задачі:

1. Дослідити вплив нітросполук на енергозалежну акумуляцію іонів Са в МХ міометрія.

2. З'ясувати властивості системи Са²⁺/Н⁺-обміну в МХ міометрія та вивчити закономірності дії нітросполук та калікс[4]аренів на її активність.

3. Вивчити вплив нітросполук та калікс[4]аренів на поляризацію внутрішньої мембрани МХ міометрія.

Об'єкти дослідження: ГМК матки та ізольовані МХ міометрія.

Предмет дослідження: системи трансмембранного обміну Са²⁺ в МХ та поляризація внутрішньої мітохондріальної мембрани.

Методи дослідження: препаративної біохімії, спектрофотометрії, спектрофлюориметрії, протокової цитофлюориметрії, фотонної кореляційної спектроскопії, світлової, електронної та лазерної конфокальної мікроскопії, кінетичного та статистичного аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів

Доведено, що Са²⁺-чутливий флюоресцентний зонд Fluo-4 AM є перспективним для вивчення змін вмісту Са²⁺ в ізольованих МХ міометрія. Із використанням зазначеного флюоресцентного зондапродемонстровано, що процес Mg-АТР^2--залежного транспорту Са²⁺ в МХ за присутності сукцинату досягає з часом стану рівноваги та характеризується насиченням за субстратом переносу, константа активації за Са²⁺ відповідає концентрації іонів Са у збуджених міоцитах поблизу МХ. Енергозалежна акумуляція Са²⁺ у МХ ефективно пригнічується рутенієвим червоним, протонофором СССР та олігоміцином.

Вперше показано, що за дії нітросполук - нітропрусиду та нітриту натрію - спостерігається зростання енергозалежної акумуляції Са²⁺ в ізольованих МХ міометрія, яке опосередковується активацією саме Са²⁺-уніпортера внутрішньої мітохондріальної мембрани. В МХ міоцитів матки вперше знайдений NO.

Із використанням специфічних антитіл проти протеїну Letm1 вперше доведено, що в МХ міометрія саме цей протеїн відповідає за Са²⁺/Н⁺-обмін. Вивчено окремі властивості Са²⁺/Н⁺-обміну, а саме: кінетика ΔрН-індукованого виходу Са²⁺ задовольняє реакції першого порядку, функціонування Са²⁺/Н⁺-обмінника є зворотним, він активується за фізіологічних значень рН та здійснюється в стехіометрії 1:1. Процесу Na/Са²⁺-обміну в МХ міометрія не виявлено. Са²⁺/Н⁺-обмінник є нечутливим до дії нітросполук, але стимулюється калікс[4]аренами С-97, С-99 та амілоридом і пригнічується іонами Mg.

Доведена можливість застосування методу лазерної конфокальної мікроскопії та флюоресцентного потенціалчутливого зонду DіОС₆(3) для візуалізації змін потенціалу МХ інтактних міоцитів матки. Вперше продемонстровано, що NO зумовлює помірне зменшення трансмембранного мітохондріального потенціалу в клітинах міометрія, тоді як калікс[4]арени С-97 та С-99 викликають транзієнтну поляризацію мітохондріальної мембрани.

Представлені результати мають принципове значення для розуміння ролі МХ у контролі Са²⁺-гомеостазу в ГМК матки та їхнього значення у забезпеченні спряження між збудженням та скороченням в міометрії.

Практичне значення одержаних результатів

Одержані дані можуть бути корисними для подальшого пошуку ефективних модуляторів функціональної активності МХ та Са²⁺-гомеостазу в ГМК. Зокрема, нітросполуки, що були досліджені, виявилися дієвими ефекторами енергозалежного накопичення іонів Са в МХ, а калікс[4]арени – системи Са²⁺/Н⁺-обміну в зазначених субклітинних структурах. Ці результати перспективні для подальшого скринінгу донорів NO та каліксаренів щодо їх специфічного, зворотного та афінного впливу на системи трансмембранного обміну Са²⁺ в МХ ГМК.

Із використанням Са²⁺-чутливого флюоресцентного зонда Fluo-4 AM та методів спектрофлюориметрії і протокової цитофлюориметрії розроблено методичний підхід для вивчення змін кількості Са²⁺ в ізольованих МХ міометрія. Застосування потенціал-чутливого флюоресцентного зонда DіОС₆(3) та методу конфокальної мікроскопії дозволяє візуалізувати зміни потенціалу МХ інтактних міоцитів матки. Продемонстровано, що із використанням NO-чутливого флюоресцентного індикатора DAF можна легко ідентифікувати місця утворення оксиду азоту в клітині.

Одержані в роботі результати та окремі методичні підходи можна використати як у науковій практиці, так і в навчальному процесі.

Особистий внесок здобувача

Головна ідея та задачі дослідження були сформульовані науковим керівником – академіком НАН України, професором, д.б.н. Костеріним С.О. Розробка методик досліджень, аналіз та інтерпретація результатів, формування основних положень та висновків роботи, підготовка до друку статей проводилась у співпраці з науковим керівником та с.н.с., д.б.н. Даниловичем Ю.В.

Дисертанткою самостійно здійснено аналіз та узагальнення відповідних літературних даних, одержано суспензії міоцитів матки щурів та ізольованих мітохондрій, проведено експериментальні дослідження з використанням методів спектрофлюориметрії, протокової цитофлюориметрії, лазерної конфокальної мікроскопії та фотонної кореляційної спектроскопії (деякі з цих дослідів - у співпраці з колегами с.н.с., д.б.н. Даниловичем Ю.В. та н.с., к.б.н. Данилович Г.В.), а також проведені кінетичний та статистичний аналіз результатів.

Апробація результатів дисертації

Матеріали дисертації було представлено на VIII Міжнародній науково-технічній конференції «Актуальні питання біологічної фізики та хімії» (м. Севастополь, Україна, 2012), IX Міжнародній науково-технічній конференції «Актуальні питання біологічної фізики та хімії» (м. Севастополь, Україна, 2013), Міжнародній міждисциплінарній науковій конференції «Біологічно активні речовини та матеріали: фундаментальні і прикладні питання отримання і використання» (м. Новий Світ, Україна, 2013), Науковій конференції молодих вчених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології ” (Київ, Україна, 2013), III Всеукраїнській науковій конференції молодих вчених “Фізіологія: від молекул до організму” (Київ, Україна, 2013), Науковій конференції молодих вчених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології ” (Київ, Україна, 2014), XI Українському біохімічному Конгресі (Київ, Україна, 2014).

Публікації

За результатами дисертації опубліковано 14 робіт, з них 6 статей у фахових наукових журналах та 8 тез доповідей у матеріалах міжнародних та вітчизняних наукових конференцій.

Структура та обсяг роботи

Дисертаційна робота викладена на 136 сторінках машинописного тексту і складається з таких розділів: «Вступ», «Огляд літератури», «Матеріали та методи досліджень», «Результати та їх обговорення», «Заключний розділ», «Висновки», «Список використаних джерел», який містить 128 посилань. Роботу ілюстровано 42 рисунками та 1 таблицею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТРОБОТИ

Огляд літератури

Огляд літератури складається з двох підрозділів. Перший присвячено біохімічним механізмам регуляції концентрації Са²⁺ в ГМК, а саме особливостям функціонування систем пасивного та енергозалежного транспорту Са²⁺ на рівні субклітинних структур, зокрема МХ. У другому підрозділі охарактеризовано ендо- та екзогенні модулятори транспорту Са²⁺ в ГМК – оксид азоту та калікс[4]арени, їхню біологічну активність.

Матеріали та методи досліджень

Препарат ізольованих МХ одержували із міометрія невагітних самок щурів за допомогою методудиференційного центрифугування [Костерин С.А. и пр., 1985; Кандаурова Н.В., 2013]. Вміст протеїну у фракції МХ визначали за стандартним методом Bradford M.M. [BradfordM.M., 1976].Середнє його значення складало 2 мг/мл, а в пробі – 50 мкг/мл.

Навантаження МХ Са²⁺-чутливим флюоресцентним зондом Fluo-4 AM (Glycine, N - [4 - [6 - [(acetyloxy)methoxy] -2,7-difluoro-3-oxo-3H-xanthen-9-yl] -2- [2- [2- [bis [2- [(acetyloxy)methoxy] -2-oxoethyl] amino] -5-methylphenoxy] ethoxy] phenyl] -N- [2- [(acetyloxy)methoxy] -2-oxoethyl] -(acetyloxy)methyl ester; C₅₁H₅₀F₂N₂O₂₃) у концентрації 2 мкМ проводили у середовищі, яке містило 10 мМ HEPES(рН 7,4; 37 ^оС), 250 мМ цукрозу, 0,1 % бичачий сироватковий альбумін протягом 30 хв при температурі 37 ^оС. Для покращення процесу навантаження барвник змішували із Pluronic F-127 (0,02 %) [Кандаурова Н.В., 2013].

Реєстрацію відносних значень рівня Са²⁺ в матриксі МХ міометрія, навантажених Fluo-4 AM (λ_зб = 490 нм, λ_фл = 520 нм), здійснювалиіз використанням флюориметричного методу на спектрофлюориметрі Quanta Master 40 РТІ (Канада). Середовище, із якого здійснювалась енергозалежна акумуляція Са²⁺ МХ, мало наступний склад [Костерин С.А. и пр., 1985; Кандаурова Н. В., 2013]: 20 мМ HEPES (рН 7,4; 37 ^оС), 250 мМ цукроза, 2 мМ калій-фосфатний буфер (рН 7,4; 37 ^оС), 3 мМ MgCl₂, 3 мМ АТР, 5 мМ сукцинат натрію; концентрація Са²⁺ становила 20-80 мкМ. Під час вивчення енергозалежної акумуляції Са²⁺ в МХ рівень ендогенної флюоресценції кислотної форми Fluo-4 АМ, пов'язаний із наявністю в матриксі іонізованого Са за його відсутності у середовищі, позначали як базальний рівень флюоресценції (F₀) і віднімали його від величини флюоресцентної відповіді, зумовленої акумуляцією Са²⁺ МХ (F). Тоді безрозмірне співвідношення (F–F₀)/F₀ буде відповідати загальноприйнятим відносним одиницям флюоресценції.

У випадку дослідження ΔрН-індукованого вивільнення іонів Са з МХ попередню енергозалежну акумуляцію Са²⁺ проводили протягом 5 хв, після чого аліквоту суспензії розводили в ізотонічному середовищі вивільнення Са²⁺ наступного складу: 20 мМ HEPES (рН 5,0-8,0; 37 ^оС), 250 мМ цукроза, 2 мМ калій-фосфатний буфер (рН 5,0-8,0; 37 ^оС), 5 мМ сукцинат натрія, 5 мкМ циклоспорин А. Концентрація Са²⁺ в середовищі вивільнення катіону становила 4 мкМ. Інтенсивність флюоресценції при дослідженні ΔрН-індукованого вивільнення Са²⁺ виражалась у відносних одиницях F/F_o, де F_o– початковий флюоресцентний сигнал при внесенні суспензії ізольованих МХ, навантажених Са²⁺, в середовище їхнього ізотонічного розведення, F – поточний флюоресцентний сигнал у відповідні проміжки часу реєстрації вивільнення Са²⁺ з МХ.

Суспензію ГМК матки невагітних самок щурів одержували із використанням колагенази і соєвого інгібітора трипсину за методом Молларда П. в модифікації [MollardP. etal., 1986; Бабич Л.Г. и пр., 1994]. Клітини зберігали в розчині Хенкса Б (на льоду) наступного складу, (мМ): NaCl – 136,9; KCl - 5,36; КН₂РО₄ - 0,44; NaHCO₃ - 0,26; Na₂НРО₄ - 0,26; CaCl₂ – 0,03; глюкоза – 5,5; HEPES (рН, 7,4; 37 ^оС) – 10. В 1 мл отриманої клітинної суспензії містилось в середньому 6,58^.10⁶ міоцитів; кількість життєздатних клітин, згідно результатів фарбування клітинного препарату превітальним барвником трипановим синім - 90-95 % від загальної кількості. Підрахунок загальної кількості і кількості життєздатних клітин проводили з використанням гемоцитометра (камери Горяєва).

Клітини для проведення конфокально-мікроскопічних досліджень (об’єм суспензії 100 мкл) іммобілізували 2 год на предметному склі, обробленому полі-L-лізином (200 мкл), при температурі 24 ⁰С. Неприкріплені міоцити відмивали розчином Хенкса Б, після чого до іммобілізованих міоцитів додавали 100 мкл розчину Б, клітини обробляли відповідними барвниками і проводили подальші дослідження. Для візуалізації МХ був залучений флюоресцентний барвник MitoTracker Orange CM-H₂TMRos у концентрації 200 нМ, а для візуалізації ядер клітин – 50 мкМ Hoechst 33342. Розподіл DiOC₆(3) (3,3’-дигексилоксакарбоцианін йодид) в клітині спостерігали за концентрації 100 нМ (при вивченні зміни мембранного потенціалу) або 500 нМ (для дослідження колокалізації барвників) [Данилович Г.В. та ін., 2011]. Іммобілізовані міоцити навантажували NO-чутливим флюоресцентним зондом DAF-FM(C₂₁H₁₄F₂N₂O₅, 4-​Amino-​5-​methylamino-​2′,7′-difluorescein, Diaminofluorescein-​FM) в концентрації 10 мкМ. Забарвлення барвниками відбувалось протягом 15 хв (24 ^оС).

Просторовий розподіл флюоресцентних барвників у клітині вивчали на лазерному скануючому конфокальному мікроскопі LSM 510 META ( “Carl Zeiss”, Німеччина). Дослідження на конфокальному мікроскопі проводили у режимі Multi Track. Флюоресценцію Hoechst 33342 збуджували за допомогою лазера при довжині хвилі 405 нм, а реєстрували при довжині 420-480 нм; для збудження флюоресценції MitoTracker Orange CM-H₂TMRos використовували лазер з довжиною хвилі 543 нм, а флюоресценцію реєстрували в діапазоні 560-615 нм. Збудження флюоресценції DiOC₆(3) здійснювали при довжині хвилі 488 нм, а її реєстрацію – в діапазоні 505-530 нм. Збуджували флюоресценцію DAF-FMза 488 нм, а реєстрували флюоресцентний сигнал в діапазоні 505-530 нм. Вивчення кінетики розподілу флюоресцентних барвників у клітині проводили у режимі TimeSeries, а для кількісного аналізу застосовували функцію ROI (“RegionOfInterest”), яка дозволяє отримувати графік залежності усередненої інтенсивності флюоресценції виділеної області від часу.

Мембранний потенціал МХ інтактних клітин реєстрували також із використанням протокового цитофлюориметра CoulterEpicsXL^TM («BeckmanCoulter», США) та зонда DiOC₆(3) (100 нМ) [Данилович Г.В. та ін., 2011]. Виміри проводились в фізіологічному середовищі Хенкса Б (24 ⁰С).

Кінетичний аналіз процесів транспорту Са²⁺ здійснювали з використанням стандартних методів біохімічної кінетики, описаних раніше [Варфоломеев С.Д. и пр., 1982; Келети Т., 1990]. Константу активації акумуляції іонів Са в МХ розраховували в координатах Лайнуівера-Берка. Початкову швидкість ΔрН-індукованого виходу іонів Са із МХ розраховували в напівлогарифмічних координатах. Коефіцієнт Хілла та константу активації ΔрН-індукованого виходу іонів Са із МХ за протонами (рН_а) розраховували, використовуючи лінеаризовані координати Хілла.

Статистичні параметри лінеаризованих графіків (коефіцієнт кореляції, тощо) розраховували методом найменших квадратів. У випадку переважної більшості лінеаризованих графіків стандартне значення коефіцієнта кореляції R становило 0,9-0,99. Статистичну обробку отриманих результатів проводили загальноприйнятими методами з використанням t-критерію Стьюдента [Кокунин В.А., 1975; Данилович Ю.В., 2009]. Кінетичні та статистичні розрахунки проводили за допомогою стандартного програмного забезпечення MS Office Excell на персональному комп'ютері типу ІВМ РС/АТ.

Синтез каліксаренфосфонових кислот С-97 (5-біс (дигідроксифосфорил) метил-25,27-дипропоксикалікс[4]арен), С-99 (5,17-біс (дигідроксифосфонілметилол)-25,27-дипропоксикалікс[4]арен), С-107 (5,17-біс (фосфоно-2-піридилметил) аміно-11,23-ди-трет-бутил-26,28-дигідрокси-25,27-дипропоксикалікс[4]арен) та С-150 (25, 27-дипропоксикалікс[4]арен) був здійснений у відділі хімії фосфоранів Інституту органічної хімії НАН України. Структура калікс[4]аренів була підтверджена із використанням методів інфрачервоної спектроскопії та ядерного магнітного резонансу. Калікс[4]арени були люб’язно надані нам професором, член-кор. НАНУ Кальченком В.І.

Результати досліджень та їх обговорення

1. Енергозалежна акумуляція іонів Са в мітохондріях міометрія та вплив нітросполук на цей процес

З метою дослідження змін концентрації Са²⁺ в МХ нами було обрано ацетоксиметильний естер Са²⁺-чутливого флюоресцентного зонду Fluo-4 АМ. Попередньо було показано, що у присутності МХ вміст кислотної форми зонда зростає з часом як наслідок розщеплення його естерифікованої форми. При додаванні до МХ, що містили активну форму барвника, Са²⁺ у зростаючій концентрації флюоресцентний сигнал збільшується. Отже, Са²⁺-чутливий флюоресцентний зонд Fluo‑4 AM цілком можна використовувати для вивчення закономірностей трансмембранного обміну Са²⁺ в ізольованих МХ гладенького м’яза.

Відомо, що МХ міометрія в середовищі без АТР та Mg²⁺ нездатні накопичувати Са²⁺ [Костерин С.А., 1990; Костерин С.А. и пр.,1993]. Було встановлено, що за присутності Mg-АТР^2- та сукцинату навантажені Fluo-4 АМ МХ ефективно накопичують Са²⁺ (80 мкМ) із стандартного інкубаційного середовища: це супроводжується зростанням рівня флюоресценції. За відсутності енергетичних субстратів і, відповідно, зменшення електричного потенціалу на внутрішній МХ мембрані, накопичення Са²⁺ було практично відсутнє.

Рис. 1. Зміни інтенсивності флюоресцентної відповіді Fluo-4 АМ відображають здатність енергізованих мітохондрій міометрія накопичувати та ефективно стаціонарно утримувати іони Са²⁺, а також швидко звільняти його за присутності кальцієвого іонофора А-23187. Метод спектрофлюориметрії. Використано стандартне середовищеінкубації. Результати типового експерименту

Додавання Са²⁺ в зростаючих кількостях до попередньо навантажених Fluo-4 АМ МХ, які знаходились у середовищі із Mg-АТР^2- та сукцинатом, таким чином, що кінцева концентрація катіона квантованостановила 20-40-60-80 мкМ, супроводжувалось збільшенням флюоресцентної відповіді із виходом на платовий рівень з часом (рис. 1). Посилення флюоресценції Fluo-4 АМ можна пояснити поступовою акумуляцією Са²⁺ у МХ, концентрація якого в середовищі послідовно збільшувалася. Ці органели мають здатність достатньо довго стаціонарно утримувати накопичений Са²⁺, про що свідчить факт стабільності флюоресцентної відповіді протягом не менше, ніж 10 хв (рис. 1). За цих умов встановлюється динамічна рівновага між транспортними процесами, які забезпечують накопичення (Са²⁺-уніпортер) та вивільнення (Са²⁺/Н⁺-обмінник) катіону МХ.

Надійна бар'єрна функція внутрішньої мембрани ізольованих МХ міометрія щодо Са²⁺ показана дослідами, в яких додавання аліквоти розчину Са²⁺-іонофору А-23187 (10 мкМ) разом із Са²⁺-хелатором ЕГТА (1 мМ) в умовах досягнення транспортувальним процесом стаціонарного рівня (80 мкМ Са²⁺ в середовищі інкубації) супроводжується різким падінням флюоресценції зонду, що свідчить про зниження концентрації катіону в МХ принаймні до базального рівня (рис. 1).

Акумуляція Са²⁺ вМХ характеризується насиченням за субстратом переносу, розрахована нами уявна константа активації транспортного процесу К_Са для іонів Са сягає 53,9±6,9 мкМ (n=5), що відповідає концентрації Са²⁺ в просторі між саркоплазматичним ретикулюмом та МХ у клітині [Rizzuto R.etal., 2009]. Отже, в принципі, величина К_Са знаходиться у межах фізіологічного діапазону концентрацій цього катіону, а її відносно високе значення підтверджує уявлення про те, що система енергозалежного транспорта Са²⁺ в МХ характеризується достатньо низькою спорідненістю до цього катіону [Костерин С.А., 1990; Костерин С.А. и пр., 1993].

В наступній серії експериментів було досліджено можливість накопичення Са²⁺ в умовах деенергізації МХ. В цих та подальших дослідах концентрація Са²⁺ в середовищі становила 80 мкМ.За умови дисипації градієнту Н⁺ при додаванніаліквоти розчину протонофоруcarbonylcyanidem-chlorophenylhydrazone(10 мкМ СССР) або блокування генерації протонного градієнту (при використанні 1 мкг/мл олігоміцину) накопичення Са²⁺ органелами знижувалось порівняно із контрольними експериментами (рис. 2). Одним з можливих пояснень цього явища є реверсне функціонування Ca²⁺/Н⁺ -обмінника. За присутності інгібітора Са²⁺-уніпортерарутенієвого червоного (10 мкМ RuR) накопичення катіона також істотно зменшувалось (рис. 2). Наявність нечутливго до RuR компонента транспорту Са²⁺ в МХ можна пояснити функціонуванням відмінних від уніпортера канальних структур та транслоказ, які, за певних умов, можливо, забезпечують накопичення іонів Са [Костюк П.Г. та ін., 2010].

Рис. 2. Порівняльна оцінка впливу протонофору СССР, олігоміцину та рутенієвого червоного (RuR) на акумуляцію Са²⁺ мітохондріями міометрія. Концентрація іонів Са в робочому середовищі становила 80 мкМ. Метод спектрофлюориметрії, флюоресцентний зонд Fluo-4 АМ. М±m, */- зміни статистично вірогідні відносно контролю, Р≤0,05, # - Р<0,2. Використано стандартне середовище інкубації

В подальших дослідах було вивчено вплив нітросполук на енергозалежну акумуляцію іонів Са МХ. Слід зазначити, що джерела утворення NO в міоцитах матки практично не ідентифіковані. Це пов’язане, в тому числі, із коротким «часом життя» і високою реакційною здатністю NO.

Присутність Са²⁺-залежної ізоформи NO-синтази вМХ окремих тканин було доведено імуногістохімічними методами [Ghafourifar P.etal., 2005; Leite A.C.etal., 2010]. Використання сучасного флюоресцентного зонда DAFдозволяє безпосередньо швидко і надійно зареєструвати продукцію NO за його низьких концентрацій (2-5 нМ) в інтактних клітинах, а метод лазерної конфокальної мікроскопії – візуалізувати його утворення та, із використанням специфічних щодо МХ зондів, довести зв’язок біосинтезу NO саме із цими органелами [Nakatsubo N.etal., 1998; Lopez-Figueroa M.O.etal., 2000]. В наших експериментах використовували активну кислотну форму DAF (DAF-FM), яка безпосередньо взаємодіє з NO за присутності O₂.

Рис. 3. Візуалізація окремих ділянок утворення NO різної інтенсивності в поодинокому міоциті матки із використанням флюоресцентного барвника DAF-FM (зелене забарвлення). Для ідентифікації локалізації ядра використаний Hoechst 33342 (синє забарвлення). Метод лазерної конфокальної мікроскопії

Проведеними дослідженнями встановлено, що в міоцитах матки спостерігається зелений флюоресцентний сигнал після передінкубації з DAF, що свідчить про базальну продукцію NO. Флюоресцентний зонд розподілявся в міоплазмі клітини, окреслюючи її контури та формуючи гетерогенні забарвлені ділянки та тяжі (рис. 3).

Рис. 4. Порівняння профілю розподілу в міоцитах матки флюоресцентних зондів, специфічних щодо мітохондрій (MitoTrackerOrangeCM-H₂TMRos, бура крива, канал 1), оксиду азоту (DAF-FM, зелена крива, канал 2) та ядра (Hoechst 33342, синя крива, канал 3). Метод лазерної конфокальної мікроскопії

Додавання до міоцитів 0,1 мМ нітропрусиду натрію, донора NO, призводило до суттєвого зростання (майже у 3 рази) флюоресцентного сигналу. Інкубація клітин із зростаючими концентраціями N-нітро-L-аргініна - інгібітора Са²⁺-залежних ізоформ NO-синтаз - супроводжувалась дозозалежним зниженням інтенсивності флюоресценції DAF в середньому на 20 % (0,1 мМ N-нітро-L-аргінін) та 40 % (0,2 мМ N-нітро-L-аргінін). Ці результати свідчать про специфічність відповіді DAF щодо NO. Є всі підстави вважати, що DAF є оптимальним NO-чутливим флюоресцентним барвником для детекції NO в інтактних міоцитах матки.

Було також продемонстровано колокалізацію специфічного щодо МХ зонда MitoTracker Orange CM-H₂TMRos, який накопичується лише в енергізованих органелах, та NO-чутливого барвника DAF (рис. 4). Комп’ютерний аналіз довільно обраного поза ядром клітинного зрізу показав тотожний розподіл обох флюоресцентних барвників.

Продукція NO в МХ інтактних міоцитів маткиможе свідчити про можливий вплив оксиду азоту на Са²⁺-транспортувальні процеси в цих органелах.

При дослідженні впливу NO на процес акумуляції іонів Са в МХ клітин міометрія як нітросполуки – донори NOбуло застосовано нітропрусид (SNP) та нітрит натрію (SN). Встановлено, що попередня інкубація МХ з нітросполуками (100 мкМ) протягом 15 хв призводила до суттєвого зростання акумуляції Са²⁺ органелами. Так, SNP посилював транспорт Са²⁺ приблизно в 1,6 рази (рис. 5). Вплив SN виявився дещо менш ефективним.

Рис. 5. Вплив модифікаторів трансмембранного обміну Са²⁺ (протонофору СССР, рутенієвого червоного (RuR)та циклоспорину А (Csp)) в мітохондріях міометрія на енергозалежний транспорт катіону в умовах активуючого впливу нітропрусиду натрія (SNP). Метод спектрофлюориметрії, флюоресцентний зонд Fluo-4 АМ. M±m; */ - зміни достовірні відносно контролю, Р≤0,05;#/- відносно дії 100 мкМ нітропрусиду натрія, Р≤0,05. Використано стандартне середовище інкубації

З метою доведення ролі Са²⁺-уніпортера в досліджуваному процесі нами було використано протонофор СССР та полікатіон – антагоніст Са²⁺ RuR. Встановлено, що 10 мкМ СССР та RuR ефективно пригнічували акумуляцію Са²⁺ в МХ за присутності SNP. Водночас, специфічний інгібітор пори перехідної проникності 5 мкМ циклоспорин А (Csp А) майже не впливав на активоване SNP енергозалежне накопичення Са²⁺ МХ (рис. 5), хоча при цьомуі спостерігалась тенденція до зростання акумуляції катіону за цих умов. Одержані результати вказують на несуттєву роль CspA-чутливої пори перехідної проникності в біохімічних механізмах стимуляції транспорту Са²⁺ в МХ під впливом нітросполук. Таким чином, можна припустити фізіологічне значення NO в стимуляції енергозалежного транспорту Са²⁺ в МХ, що є важливим для зниження концентрації Са²⁺ в міоплазмі.

Отже, нами було продемонстровано, що Са²⁺-чутливий флюоресцентний зонд Fluo-4 AM можна успішно використовувати для вивчення закономірностей трансмембранного обміну іонів Са в ізольованих МХ гладенького м'язу. Також проілюстровано, що існує феномен накопичення Са²⁺ деенергізованими МХ міометрія. Було показано присутність NO в МХ інтактних міоцитів матки. Доведено, що під впливом нітросполук спостерігається посилення енергозалежної акумуляції Са²⁺ в ізольованих МХ міометрія. Стимулювальний ефект опосередковується активацією Са²⁺-уніпортера і не залежить від функціонування пори перехідної проникності.

2. Система Са²⁺/Н⁺-обміну мітохондрій міометрія та вплив нітросполук і вибраних калікс[4]аренів на її активність

Було досліджено процес вивільнення Са²⁺ із МХ, попередньо акумульованого в енергозалежному процесі протягом 5 хв (за присутності Mg-АТР^2- та сукцинату), який залежав від величини позамітохондріального рН (рН 8,0-5,0), рис. 6. При закисленні середовища суттєво посилюється вихід Са²⁺ з МХ, що свідчить на користь існування ∆рН-залежного компоненту транспорту Са²⁺ з МХ і відповідає уявленням про існування Са²⁺/Н⁺-обміну у внутрішній мітохондріальній мембрані гладеньких м’язів. При залужненні позамітохондріального середовища спостерігається додаткове зростання акумуляції катіону, що свідчить на користь можливості функціонування Са²⁺/Н⁺-обміну в реверсному режимі (рис. 6).

Рис. 6. Транспорт Са²⁺ в мітохондріях за умови зміни рН стандартного середовища інкубації. Ефективність процесу залежить від величини ∆рН. Метод спектрофлюориметрії, флюоресцентний зонд Fluo-4 АМ. Результат типового експерименту

Проведені розрахунки показали, що за умови зростання градієнту протонів, як рушійної сили виходу Са²⁺ з МХ (при закисленні середовища від рН 7,5 до рН 5,0), час напіввивільнення катіону (t_1/2) зменшується майже у 5 разів. Отже, швидкість Са²⁺/Н⁺-обміну зростає в умовах збільшення ∆рН на мембрані МХ.

Рис. 7. Залежність початкової швидкості вивільнення іонів Са з мітохондрій від концентрації протонів. Метод спектрофлюориметрії, флюоресцентний зонд Fluo-4 АМ. (М±m, n=6-8)

Згідно сучасних уявлень [Schlickum S.etal., 2004; Dimmer K.S.etal., 2008; Nowikovsky K.etal., 2012], молекулярною структурою, яка забезпечує функціонування Са²⁺/Н⁺-обмінника у внутрішній мембрані МХ, виступає протеїн Letm1 (leucine-zipper-EFhand-containingtransmembraneregion). Нами було встановлено, що комерційні моноклональні антитіла проти Letm1 (Anti-Letm1) суттєво пригнічували процес ∆рН-індукованого вивільнення Са²⁺ з мітохондріального матриксу; ефект залежав від часу інкубації МХ з антитілами. Отже, є підстави припустити, що МХ міометрія щурів володіють транспортною системою Са²⁺/Н⁺-обмінника, яка представлена протеїном Letm1.

Крива залежності швидкості вивільнення іонів Са з ізольованих МХ міометрія від концентрації протонів в середовищі їхнього розведення має тенденцію до насичення (рис. 7), а розрахована нами константа активації за протонами (-lgK_а або рК_а) cкладає 6,9±0,1 (n=6), що свідчить про можливість функціонування системи Na⁺-незалежного виходу Са²⁺ з МХ за близького до фізіологічного значення рН. Величина коефіцієнту Хілла (n_H) становить 0,90±0,05 (n=6), що вказує на стехіометрію Са²⁺/Н⁺-обміну 1:1 і, відповідно, електрогенність транспортувальної системи (1 Са²⁺ обмінюється на 1H⁺).

Рис. 8. Вибрані калікс[4]арени (С-97 та С-99) стимулюють ∆рН-індукований транспорт Са²⁺ в мітохондріях.Метод спектрофлюориметрії, флюоресцентний зонд Fluo-4 АМ. M±m; */- зміни достовірні відносно контролю Р<0,1; **/- Р<0,05.Cтандартне середовище інкубації (рН 6,5)

Подальші експерименти було спрямовано на пошук ендо- та екзогенних модифікаторів Са²⁺/Н⁺-обміну. Нас зацікавили калікс[4]арени С-97 та С-99 як такі, що здатні модулювати з високою ефективністю широкий спектр АТР-гідролазних реакцій, в тому числі і тих, що пов’язані із трансмембранним транспортуванням катіонів [Лабинцева Р.Д. та ін., 2007; Бевза О.В. та ін., 2013; Veklichetal., 2014]. Нами встановлено, що вибрані калікс[4]арени – інгібітори натрієвої помпи плазматичної мембрани, високоафінно стимулюють Са²⁺/Н⁺-обмін (рис. 8).

Відомо, що транспортування Са²⁺ у внутрішній мембрані МХ модулюється іонами Mg та діуретиками (амілорид) [GunterT.E.etal, 1990]. В наших дослідженнях 4,5 мМ Mg²⁺ пригнічував, а 100 мкМ амілорид - стимулював Са²⁺/Н⁺-обмін.

Водночас, Са²⁺/Н⁺-обмін виявився нечутливим до дії нітросполук. Отже, стимуляція NOенергозалежної акумуляції іонів Са органелами на фоні відсутності ефекту на вихід катіону може забезпечити ефективне зниження концентрації Са²⁺ в міоплазмі поблизу МХ.

Таким чином, нами ідентифіковано Са²⁺/Н⁺-обмінник в МХ міометрія щурів. Молекулярною основою функціонування транспортувальної системи є протеїн Letm1. Антипортер працює за фізіологічних значень рН зі стехіометрію 1:1, що вказує на його електрогенність. Обмінник є нечутливим до дії нітросполук, але стимулюється калікс[4]аренами С-97, С-99 та амілоридом і пригнічується іонами Mg.

3. Вплив нітросполук та вибраних калікс[4]аренів на поляризацію внутрішньої мембрани мітохондрій міометрія.

З метою дослідження впливу нітросполук на ступінь поляризації внутрішньої мембрани МХ в міоцитах ми використали метод лазерної конфокальної скануючої мікроскопії та потенціалчутливий зонд карбоціанінового ряду DiOC₆(3). Встановлено, що розподіл специфічного щодо МХ флюоресцентного барвника MitoTrackerOrange та DiOC₆(3) в міоплазмі має подібний характер (рис. 9). Це дає підставу вважати, що накопичення DiOC₆(3) в клітині передусім пов’язане із МХ.

Рис. 9. Розподіл флюоресцентних зондів в міоциті матки: а - зелений – DiOC₆(3), б - червоний – MitoTrackerOrangeCM-H₂TMRos, в – накладання обох зображень; фіолетовий – Hoechst 33342. Метод лазерної конфокальної мікроскопії

Подальшими експериментами виявлено, що 0,1 мМ SNP призводив до зниження флюоресценції DіОС₆(3) в середньому на 17 %. В порівняльних дослідженнях SN у аналогічній концентрації не чинив будь-якого ефекту на флюоресценцію. Одержаний результат був якісно підтверджений нами із використанням методу протокової цитофлюориметрії.

Помірне зниження потенціалу внутрішньої мембрани МХ за дії SNP можна пояснити стимуляцією NO транспорту позитивно заряджених іонів Са у матрикс, а також пригніченням роботи окремих комплексів електрон-транспортувального ланцюга внаслідок гальмівної дії NO на них. Відомо, що збільшення Δφ на внутрішній МХ мембрані призводить до генерації супероксид-аніону убісеміхіноном та комплексом I. Отже, ми розглядаємо зареєстроване нами зменшення мітохондріального потенціалу за дії нітросполук як прояв протекторної дії оксиду азоту, який спроможний захищати МХ від надлишкової продукції супероксид-аніону, а також Са²⁺-перевантаження [Костюк П.Г. та ін., 2010].

Рис. 10. Дія калікс[4]аренів С-97 (а) та С-99 (б) на поляризацію внутрішньої мітохондріальної мембрани. Стрілочкою вказано момент додавання (на 3 хв інкубації клітин з зондом) 1мМ уабаїну (1) або 1мМ уабаїну+5мМ азиду натрію (2) та (на 8 хв) калікс[4]аренів (100 нМ). Метод протокової цитофлюориметрії, флюоресцентний зонд DiOC₆(3).Стандартне середовище інкубації. Результати характерного досліду

Оскільки Са²⁺/Н⁺-обмін в МХ міометрія може здійснюватись в електрогенному режимі, його стимуляція калікс[4]аренами повинна призвести до зростання мітохондріального потенціалу. Згідно результатів протокової цитофлюориметрії, калікс[4]арени С-97 та С-99 викликали транзієнтну поляризацію мітохондріальної мембрани, тривалість якої становила біля 5 хв. За умов одночасної деполяризації плазматичної і мітохондріальної мембрани, спричиненою попередньою інкубацією клітин з 1 мМ уабаїном та 5 мМ азидом натрію, внесення зазначених калікс[4]аренів не викликало змін в інтенсивності флюоресценції зонду (рис. 10). Одержані результати підтверджено методом лазерної конфокальної мікроскопії.

Таким чином,NO викликає помірне зменшення трансмембранного мітохондріального потенціалу в клітинах міометрія. Калікс[4]арени С-97 та С-99 здатні викликати транзієнтну поляризацію мітохондріальної мембрани, що узгоджується із фактом активації ними Са²⁺/Н⁺ -обмінника.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі в дослідах, виконаних на ізольованих мітохондріях та міоцитах матки щурів, було вивчено трансмембранний обмін Са²⁺ в мітохондріях міометрія та поляризацію їхньої мембрани за дії оксиду азоту та калікс[4]аренів із застосуванням методів спектрофлюориметрії, протокової цитофлюориметрії та лазерної конфокальної мікроскопії.

За результатами роботи зроблено наступні висновки:

1. Са²⁺-чутливий флюоресцентний зонд Fluo 4-AMдоцільно використовувати для вивчення закономірностей обміну Са²⁺ в ізольованих мітохондріях міометрія.

2. Вперше доведено наявність NO в мітохондріях міоцитів матки. Оксид азоту посилює енергозалежну акумуляцію іонів Са мітохондріями міометрія. Стимулювальний ефект опосередкований активацією Са²⁺-уніпортера та не залежить від функціонування пори перехідної провідності.

3. При дослідженні властивостей Са²⁺/Н⁺-обміну у внутрішній мембрані мітохондрій міометрія було встановлено, що антипортер активується за фізіологічних значень рН та функціонує із стехіометрією 1:1.

4. Са²⁺/Н⁺-обмін в мітохондріях міометрія є нечутливим до дії оксиду азоту, але стимулюється калікс[4]аренами С-97, С-99 та амілоридом і пригнічується іонами Mg.

5. Із використанням специфічних щодо мітохондрій флюоресцентних зондів встановлено, що потенціалчутливий барвник ціанінового ряду DIOC₆(3) зв'язується з енергізованими мітохондріями міометрія і його можна використовувати для тестування змін мітохондріального потенціалу.

6. Доведено, що оксид азоту спричиняє зниження потенціалу на внутрішній мембрані мітохондрій.

7. Калікс[4]арени С-97 та С-99 викликають виражену транзієнтну поляризацію внутрішньої мембрани мітохондрій, що узгоджується з їхнім стимулюючим впливом на Са²⁺/Н⁺-обмінник.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Данилович Г.В. Зміни поляризації плазматичної та внутрішньої мітохондріальої мембран клітин міометрія за дії каліксаренів – інгібіторів Na⁺, K⁺-АТР-ази плазматичної мембрани / Г.В. Данилович, Ю.В. Данилович, О.В. Коломієць, С.О. Костерін, Р.В. Родік, С. О. Черенок, В.І. Кальченко, О.Ю. Чуніхін, В. Ф. Горчєв, С. О. Карахім // Укр. біохім. журн. –2012. - Т.84, № 6. - С. 37-48. (Особистий внесок здобувача – виділення гладеньком'язових клітин матки щурів, участь у проведенні експериментів, участь у обговоренні результатів експериментів та написанні рукопису статті).

2. Коломієць О.В. Вивчення акумуляції Са²⁺ в ізольованих мітохондріях гладенького м'яза за допомогою зонда Fluo-4 AM / О.В. Коломієць, Г.В. Данилович, Ю.В. Данилович, С.О. Костерін // Укр. біохім. журн. –2013. - Т.85, № 4. - С. 30-39. (Особистий внесок здобувача – виділення ізольованих мітохондрій міометрія щурів, проведення експериментів, кінетичний аналіз та статистична обробка даних, участь у обговоренні результатів експериментів та написанні рукопису статті).

3. Данилович Ю.В. Дослідження впливу нітрозактивних сполук на поляризацію внутрішньої мембрани мітохондрій в міоцитах матки щурів із використанням потенціалчутливого флюоресцентного зонда DіОС₆(3) / Ю.В. Данилович, Г.В. Данилович, О.В. Коломієць, С.О. Костерін, С.О. Карахім О.Ю. Чуніхін // Укр. біохім. журн. –2014. - Т.86, № 1. - С. 42-55. (Особистий внесок здобувача – виділення гладеньком'язових клітин матки щурів, участь у проведенні експериментів, участь у обговоренні результатів експериментів та написанні рукопису статті)

4. Коломієць О.В. Са²⁺/Н⁺-обмін у мітохондріях міометрія / О.В. Коломієць, Ю.В. Данилович, Г.В. Данилович, С.О. Костерін // Укр. біохім. журн. –2014. - Т.86, № 3. - С. 41-48. (Особистий внесок здобувача – виділення ізольованих мітохондрій міометрія щурів, проведення експериментів, кінетичний аналіз та статистична обробка даних, участь у обговоренні результатів експериментів та написанні рукопису статті).

5. Данилович Ю.В. Оксид азоту як один із регуляторів енергозалежного транспорту Са²⁺ в мітохондріях міометрія / Ю.В. Данилович, О.В. Коломієць, Г.В. Данилович, С.О. Костерін // Фізіол. журн. –2014. - Т.60, № 2. - С. 12-17. (Особистий внесок здобувача – виділення ізольованих мітохондрій міометрія щурів, проведення експериментів, статистична обробка даних, участь у обговоренні результатів експериментів та написанні рукопису статті).

6.Коломієць О.В. Н⁺–Са²⁺-обмінник у мітохондріях міометрія: модуляція екзо- та ендогенними сполуками / О.В. Коломієць, Ю.В. Данилович, Г.В. Данилович // Фізіол. журн. –2014. - Т.60, № 5. – С. 33-42. (Особистий внесок здобувача – виділення ізольованих мітохондрій міометрія щурів, проведення експериментів, статистична обробка даних, участь у обговоренні результатів експериментів та написанні рукопису статті).

7. Данилович А.В. Влияние каликс[4]аренов - ингибиторов Na⁺, K⁺-АТР-азы на поляризацию плазматической и митохондриальной мембран гладкомышечных клеток матки / А.В. Данилович, Ю.В. Данилович, О.В. Коломиец // Тези доповідей VIII Міжнародної науково-технічної конференції «Актуальні питання біологічної фізики та хімії». Севастополь. Україна. – 2012. – С. 168-169.

8. Коломієць О.В. Окремі закономірності акумуляції іонів Са в ізольованих мітохондріях міометрія, досліджені із використанням Са²⁺-чутливого флюоресцентного зонду Fluo-4 АМ / О.В. Коломієць, Ю.В. Данилович, Г.В. Данилович // Тези доповідей ІХ Міжнародної науково-технічної конференції «Актуальні питання біологічної фізики та хімії». Севастополь. Україна. – 2013. – С. 147-148.

9. Данилович Ю.В. Использование метода лазерной конфокальной микроскопии и потенциалчувствительного флюоресцентного зонда DiОC₆(3) для исследования влияния нитрозактивных соединений на поляризацию внутренней митохондриальной мембраны гладкомышечных клеток / Ю.В. Данилович, А.В. Данилович, О.В. Коломиец, А.Ю. Чунихин, Карахим С.А. // Тези доповідей Міжнародної міждисциплінарної наукової конференції «Біологічно активні речовини та матеріали: фундаментальні і прикладні питання отримання і використання». Новий Світ. Україна. – 2013. – С. 103.

10. Коломієць О.В. Дослідження властивостей транспортування Са²⁺ в мітохондріях міометрія з використанням флюоресцентного зонда Fluo-4 АМ / О.В. Коломієць, Ю.В. Данилович, Г.В. Данилович // Тези доповідей Наукової конференції молодих вчених «Актуальні проблеми біохімії та біотехнології». Київ. Україна. – Укр. біохім. журн. –2013. - Т.85, № 4. - С. 139.

11. Коломієць О.В. Вплив оксиду азоту на трансмембранний обмін Са²⁺ та поляризацію внутрішньої мембрани мітохондрій гладенького м'язу / О.В. Коломієць, Ю.В. Данилович, Г.В. Данилович // Тези доповідей III Всеукраїнської наукової конференції молодих вчених «Фізіологія: від молекул до організму» . Київ. Україна. – 2013. – С. 15-16.

12. Коломієць О.В. Електрогенний Са²⁺/Н⁺-обмін у мітохондріях міоцитів матки та його модуляція калікс[4]аренами / О.В. Коломієць, Ю.В. Данилович, Г.В. Данилович // Тези доповідей Наукової конференції молодих вчених «Актуальні проблеми біохімії та біотехнології». Київ. Україна. – Укр. біохім. журн. –2014. - Т.86, № 4. - С. 202.

13. Данилович Ю.В. Оксид азоту – потенційний регулятор Са²⁺-гомеостазу гладенького м’яза матки та рівня поляризації його субклітинних структур / Ю.В. Данилович, Г.В. Данилович, О.В. Коломієць // Тези доповідей ХІ Українського біохімічного конгресу. Київ. Україна. – Ukr. Biochem. J. –2014. - Vol.86, N 5. - С. 100-101.

14. Коломієць О.В. Оксид азоту як можливий регулятор функціональної активності мітохондрій / О.В. Коломієць, Ю.В. Данилович, Г.В. Данилович // Тези доповідей ХІ Українського біохімічного конгресу. Київ. Україна. – Ukr. Biochem. J. –2014. - Vol.86, N 5. - С. 163-164.

АНОТАЦІЯ

Коломієць О. В. Трансмембранний обмін Са²⁺ в мітохондріях міометрія за дії оксиду азоту та калікс[4]аренів. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04. – біохімія. Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ, 2015.

Із використанням методів спектрофлюориметрії, протокової цитофлюориметрії та лазерної конфокальної мікроскопії за допомогою Са²⁺-чутливого флюоресцентного зонду Fluo 4-AMта потенціалчутливого зонду DIOC₆(3) в дослідах, виконаних на ізольованих мітохондріях та міоцитах матки щурів, було досліджено властивості систем трансмембранного обміну Са²⁺, а саме Са²⁺-уніпортеру та Са²⁺/Н⁺-обмінника внутрішньої мембрани мітохондрій, модулюючу дію на них нітросполук та вибраних калікс[4]аренів, а також вплив цих речовин на поляризацію внутрішньої мембрани мітохондрій.

Доведено, що Са²⁺-чутливий флюоресцентний зонд Fluo 4-AM можна використовувати для вивчення закономірностей обміну Са²⁺ в мітохондріях міометрія. Показано, що оксид азоту утворюється і посилює енергозалежну акумуляцію іонів Са в мітохондріях міометрія. Стимулюючий ефект опосередкований активацією Са²⁺-уніпортера та не залежить від функціонування пори перехідної провідності. Досліджено властивості Са²⁺/Н⁺-обміну у внутрішній мембрані мітохондрій міометрія, зокрема, встановлено, що він здійснюється з стехіометрією 1:1 та функціонує за фізіологічних значень рН. Виявлено, що Са²⁺/Н⁺-обмін є нечутливим до дії оксиду азоту, але стимулюється калікс[4]аренами С-97, С-99 та амілоридом і пригнічується іонами Mg. Встановлено, що потенціалчутливий барвник ціанінового ряду DіOC₆(3) зв'язується з енергізованими мітохондріями і його можна використовувати для тестування змін мітохондріального потенціалу. Доведено, що оксид азоту спричиняє зниження потенціалу на внутрішній мембрані мітохондрій. Показано, що калікс[4]арени С-97 та С-99 викликають виражену транзієнтну поляризацію внутрішньої мембрани мітохондрій, що узгоджується з їхнім стимулювальним впливом на Са²⁺/Н⁺-обмін.

Одержані результати мають значення для розуміння ролі мітохондрій у контролі Са²⁺-гомеостазу в гладеньком'язових клітинах матки та їхнього функціонування у забезпеченні спряження між збудженням та скороченням в міометрії.

Ключові слова: Са²⁺, мітохондрії, клітини гладенького м’язу, оксид азоту, калікс[4]арени, міометрій.

АННОТАЦИЯ

Коломиец О. В. Трансмембранный обмен Са²⁺ в митохондриях миометрия при действии оксида азотаи каликс[4]аренов. – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04. – биохимия. Институт биохимииим. О.В.Палладина НАН Украины, Киев, 2015.

Используя методы спектрофлуориметрии, проточной цитофлуориметрии и лазерной конфокальной микроскопии с помощьюСа²⁺-чуствительного флуоресцентного зонда Fluo 4-AM,NO-чувствительного зондаDAFи потенциалчувствительного зонда DiOC₆(3) в опытах, выполненных на изолированных митохондриях и миоцитах матки крыс, было показано образование оксида азота в митохондриях миоцитов матки, исследованысвойства систем трансмембранного обмена Са²⁺, а именно Са²⁺-унипортераи Са²⁺/Н⁺-обменника внутренней мембраны митохондрий, модулирующее действие на них нитросоединенийиизбранных каликс[4]аренов, а такжевлияниеэтихвеществ на поляризацию внутренней мембраны митохондрий.

Доказано, что Са²⁺-чувствительныйфлуоресцентный зонд Fluo 4-AM можноиспользовать для изучения закономерностей обмена Са²⁺ в митохондриях миометрия. С помощьюNO-чувствительногофлуоресцентного зондаDAFоксид азотавпервые идентифицированв митохондриях миоцитов матки.Показано, что оксид азота усиливаетэнергозависимую аккумуляциюионов Са в митохондриях миометрия. Стимулирующее действие опосредовано активацией Са²⁺-унипортера и не зависитот функционивания циклоспоринчувствительной митохондриальной поры. Эти эффекты могут иметь функциональное значение в стимуляцииNOэнергозависимого транспорта Са²⁺ митохондриями, что важно для снижения концентрации Са²⁺ в миоплазме.

Идентифицирован Са²⁺/Н⁺-обменник в митохондриях миометрия крыс.С помощью моноклональных антител установлено, что данная транспортная система репрезентирована протеином Letm1.Исследованысвойства Са²⁺/Н⁺-обмена во внутренней мембране митохондрий миометрия, в том числеустановлено, что оносуществляетсяв стехиометрии 1:1, что указывает на его электрогенность,и функционируетпри физиологических значениях рН. Показано, что Са²⁺/Н⁺-обмен резистентныйк действию оксида азота, но стимулируется каликс[4]аренами С-97, С-99 и амилоридом, а также угнетаетсяионами Mg. С использованием специфических к митохондриям флуоресцентных зондов установлено, что потенциалчуствительныйкраситель цианинового рядаDіOC₆(3) связываетсяс энергизированными митохондриями и его можноиспользовать для тестированияизменений митохондриального потенциала. Доказано, что оксид азотаспособствуетумеренному снижению потенциала на внутренней мембране митохондрий, что может быть проявлением его протекторного действия. Показано, что каликс[4]арены С-97 и С-99 вызывают выраженную транзиентную поляризацию внутренней мембраны митохондрий, что согласовывается с их стимулирующимвлиянием на Са²⁺/Н⁺-обмен.

Полученные результатыимеют значение для понимания ролимитохондрий в контроле Са²⁺-гомеостазагладкомышечныхклетокматки и их значения вобеспечениисопряжения между возбуждениеми сокращением в миометрии.

Ключевые слова: Са²⁺, митохондрии, клеткигладкой мышцы, оксид азота, каликс[4]арены, миометрий.

SUMMARY

Kolomiets O.V.TransmembraneCa2+ exchangeinmyometrialmitochondriainconditionsofnitricoxideandcalix[4]areneinfluence. – Manuscript.

Dissertation thesis on obtaining the scientific degree of PhD (Biology) in the speciality 03.00.04. – biochemistry. Palladin Institute of Biochemistry of NAS of Ukraine, Kyiv, 2015.

By spectroscopy, flow cytometry and laser confocal microscopy study with Ca²⁺-sensitive dye Fluo-4 AM and potential-sensitive dye DIOC₆(3) in experiments, performed on isolated mitochondria and myocytes of rat uterus, was investigated properties of Ca²⁺ transmembrane exchange systems, namely Ca²⁺ uniporter and Ca²⁺/H⁺-exchanger of inner mitochondrial membrane, by influencing nitrocompoundsand calix[4]arenes, and also impact of those compounds on inner mitochondrial membrane polarization.

It is confirmed, that Ca²⁺-sensitive fluorescent dye Fluo-4 AM can be used for investigation Ca²⁺ exchange regularities in myometrium mitochondria. It is shown that nitric oxide increase energy-dependent accumulation of Ca ions in myometrial mitochondria. This effect is mediated by Ca²⁺-uniporter activation and do not dependent on PTP functioning.It is investigated Ca²⁺/H⁺-exchange properties in inner membrane of myometrium mitochondria, namely this exchange has stoichiometry 1:1 and functioning in different pH. It is found that Ca²⁺/H⁺ exchange resistant to nitric oxide influence, but stimulated by calix[4]arene C-97, C-99 and amilorideand inhibited by Mg ions. It is established that potential-sensitive dye of cyanide group DіOC₆(3) binds with energizedmithochondia and can be used for testing mitochondrial potential changes. It is confirmed that nitric oxide cause mitochondrial inner membrane potential decrease. It is shown that calix[4]arene C-97 and C-99 provoke transient mitochondrial inner membrane polarization, which cohere with its stimulating influence on Ca²⁺/H⁺-exchange.

The obtained results are important for understanding the role of mitochondria in control of Ca^{2 +} homeostasis in uterus smooth muscle cells and their functioning in ensuring the coupling between excitation and contraction in the myometrium.

Key words: Ca²⁺, mitochondria, smooth muscle cells, nitric oxide, calix[4]arenes, myometrium.

ВІДГУК
на дисертаційну роботу КОЛОМІЄЦЬ ОКСАНИ ВАЛЕРІЇВНИ «ТРАНСМЕМБРАННИЙ ОБМІН Са2+ В МІТОХОНДРІЯХ МІОМЕТРІЯ ЗА ДІЇ ОКСИДУ АЗОТУ ТА КАЛІКС[4]АРЕНІВ», представлену на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. (ВІДГУК1- pdf,ВІДГУК2- pdf )