ЛАЗЕРНИЙ СКАНУЮЧИЙ КОНФОКАЛЬНИЙ МІКРОСКОП

LSM 510 META

Мікроскоп:

Inverted Axiovert 200 M with Carl Zeiss Objectives

Серводвигун на постійному струмі з з оптоелектронним керуванням

Мінімальний крок сканування по осі Z – 50 нм

Джерела світла:

Галогенна лампа

Ртутна лампа HBO 100

Лазерний модуль:

   Аргоновий лазер: 30 мВт (458 нм, 477 нм, 488 нм, 514 нм, 514 нм)

   Гелій-неоновий лазер: 5 мВт (633 нм)

   Гелій-неоновий лазер: 1 мВт (543 нм)

   Діодний лазер: 30 мВт (405 нм)

Об’єктиви:

10х/0,3

40х/1,30 OilDIC

40x/0,6 Korr

63x/0,75 Korr

63x/1,4 Oil DIC

100x/1,4 Oil DIC

Фазовий контраст

Скануючий модуль LSM 510 META:

Режими роботи:

Vis (візуально у видимому та УФ-світлі)

Camera (TV) (зображення у видимому та УФ-світлі)

LSM (детектування флуоресценції зразка, викликаної збудженням лазерним опроміненням, у 4 незалежних каналах та побудова зображення об’єкта за флуоресцентною емісією)

Технології LSM:

Single Track

MultiTracking

Ratio

Lambda Mode

Time Series

3d View

Bleach Mode

Z-Stack

Kinetic

Ion Concentration

UnmixSpectra

Коротко про можливості мікроскопа:

Конфокальний лазерний скануючий мікроскоп LSM 510 META, що виробляється компанією CarlZeiss, є найновішою модифікацією LSM-мікроскопів і має ряд незаперечних переваг, порівняно з аналогічними системами.

Перш за все, модель LSM 510 META дозволяє використовувати всі характерні для всієї серії LSM 510 функції:

            – створення трьохвимірного (або чотирьохвимірного з урахуванням часової координати) зображення зразку з елементами об’ємної реконструкції, анімації та кількісного аналізу

            – сканування методом мультитрекінгу, що дозволяє у випадку незначного перекривання емісійних спектрів флуоресцентних барвників, послідовно використовувати кілька лазерних ліній та відповідних детектуючих каналів для отримання чистого, розділеного на окремі компоненти, мультифлуороесцентного зображення

            – використання поряд зі звичайним скануванням інших технологій (FRAP, FRET з кількісною оцінкою) для дослідження певної довільно вибраної ділянки досліджуваного зразка (ROI функція) будь-якої геометричної форми завдяки системі AOTF (акустооптичний плавнорегулюючий фільтр), яка дозволяє миттєво з кроком в 0,1% змінювати інтенсивність кожноїлазерної лінії від 0 до 100%

Проте головною родзинкою LSM 510 META, її відмінною рисою, є наявність 32 канального МЕТА-детектора. Пройшовши через конфокальну діафрагму, емісійний сигнал, попередньо розкладений на спектральні компоненти, одночасно детектується у 32 незалежних високочутливих каналах. Таким чином, кожна точка, що сканується (піксель), окрім трьох координат несе також і інформацію про спектральний розподіл інтенсивності (LambdaStack), що в подальшому дозволяє аналізувати мультифлуоресцентне зображення з високим ступенем розділення спектральних профілів на компоненти, незалежно від ступеня їх перекривання.

Функція незмішуваного лінійного розділення дозволяє піксел за пікселем прецизійно розділяти сумарний сигнал на складові та ідентифікувати спектр кожного флуоресцентного барвника окремо. В якості спектрів порівняння використовують індивідуальні емісійні спектри флуоресцентних маркерів (технологія “Емісійна дактилоскопія”).

Одночасне застосування в конфокальному мікроскопі LSM 510 META технологій мультитрекінгу та емісійної дактилоскопії дозволяє усунути проблему перекриття флуоресцентних емісійних спектрів при мультифлуоресцентному аназізі зображень.

Які завдання можна вирішити за допомогою конфокального мікроскопа

Однією з головних сфер застосування конфокального мікроскопа, що обумовлено його високою роздільною здатністю та контрастом, є дослідження структури клітин ті їх органоїдів, наприклад, цитоскелету, ядра, хромосом, або навіть локалізації в них окремих генів.

Конфокальну мікроскопію застосовують також для дослідження колокалізації в клітині двох чи більшої кількості речовин, наприклад, білків. Такі дослідження допомагають краще зрозуміти, чи існує між ними причинно-наслідковий зв'язок. Попередньо білки помічають антитілами з різними флуорохромами. З допомогою звичайного мікроскопа важко визначити, знаходяться вони поряд чи один під іншим. За допомогою конфокальної мікроскопії це можна визначити. Зберігши у пам’яті комп’ютера серію оптичних зрізів, можна провести об’ємну реконструкцію зразка та отримати його тривимірне зображення, не використовуючи трудомістку методику виготовлення та фотографування серійних гістологічних зрізів.

Ще однією задачею для конфокальної мікроскопії є дослідження динамічних процесів, що відбуваються у живих клітинах. Наприклад, рух катіонів кальцію та інших речовин через клітинні мембрани. Це можна досліджувати на високошвидкісному конфокальному мікроскопі.

Новими перспективними напрямками у конфокальній мікроскопії є методики FRAP (FluorescenceRecoveryAfterPhotobleaching – Відновлення флуоресценції після фотовипалювання) та FRET (FluorescenceResonanceEnergyTransfer) – Передача енергії за допомогою флуоресцентного резонансу. FRAP використовують для досліджень рухливості біоорганічних молекул шляхом ініціації фотохімічного розкладу флуорохрома у зоні опромінення та подальшого його роз’єднання з молекулами. Після випалювання молекули з флуорохромом з неопроміненої зони рухаються внаслідокдифузії в опромінену зону зразка. За часом наростання в ній флуоресценції можна робити висновок про рухливість молекул.

FRET застосовують для визначення відстані між молекулами різних типів, їх взаємодії та оточення. Молекули мітять двома флуорохромами зі спектром випромінення донора, що перекривається спектром поглинання акцептора. В результаті резонансу між енергетичними рівнями енергія від донора передається до акцептора, що перебуває поряд на відстані порядка кількох нанометрів. Ймовірність резонансу залежить від відстані між молекулами, тому її можна вимірювати за допомогою конфокального мікроскопа, реєструючи енергію, що випромінюється акцептором у видимій області спектру.