УДК 57.083.3:616.578.7:616.579.61
Л.М. Коршун, Г.В. Ковтонюк
Оптимізація умов бактеріальної експресії рекомбінантних АНАЛОГІВ глікопротеїну G вірусу простого герпесу 2 типу, та їх АНТИГЕНні властивості
АТЗТ НВК «Діапроф-Мед», Київ, Україна, KL2004@ukr.net
На сьогоднішній день у всьому світі зростає розповсюдженість інфекцій, спричинених вірусами простого герпесу типів 1 та 2 (ВПГ-1 та ВПГ-2, відповідно). Захворювання, викликані ВПГ-2, протікають у більш тяжкій формі, з частішими рецидивами та ускладненнями, порівняно з ВПГ-1. Тому при проведенні клініко-лабораторних досліджень важлива диференційна діагностика між цими типами вірусу. Серед скринінгових лабораторних досліджень найбільш поширеним є метод твердофазного імуноферментного аналізу (ІФА). При розробці діагностичних тест-систем застосовують нативні білки ВПГ або їх рекомбінантні аналоги.
Мета даної роботи полягала в оптимізації умов бактеріальної експресії рекомбінантного аналогу типоспецифічного глікопротеїну G ВПГ-2 в клітинах бактерій Escherichia coli та отримання високоактивного препарату, придатного для використання у складі імуносорбенту при розробці діагностичних тест-систем.
На основі вектору pET28а були сконструйовані дві рекомбінантні плазміди: рЕТ28-Gal-HSV2gG та pET28-GST-HSV2gG, продукти експресії яких в бактеріальній системі E.coli BL21(DE3) є поліпептидами, що містять імунодомінантні ділянки глікопротеїну G ВПГ-2 та послідовності N-кінцевого фрагменту ?-галактозидази (Gal-HSV2gG) або глутатіон-S-трансферази (GST-HSV2gG), відповідно. Виявлено залежність рівня біосинтезу цільових білків та їх антигенних властивостей від особливостей генно-інженерної конструкції та умов культивування продуцентів. Дослідження антигенних властивостей очищених білків у форматі непрямого ІФА показало, що використання білку GST-HSV2gG дозволяє підвищити чутливість діагностичної тест-системи для визначення імуноглобулінів класу G до ВПГ-2 у 1,43 рази, порівняно з білком Gal-HSV2gG.
Встановлено, що поліпептид GST-HSV2gG накопичується у клітинах бактерій E. coli як у розчинній формі, так і в тільцях включень. Показано, що антигенна активність розчинного білку у 3 рази (р<0,05) вище, ніж з тілець включень. Найбільш високий рівень синтезу білку у розчинній формі було досягнуто за умов культивування продуценту з використанням середовища ТВ та індукції культури 0,1 мМ ІПТГ у фазі прискорення росту з подальшим культивуванням впродовж 3,5 год при температурі 37 °С.
Рекомбінантний білок GST-HSV2gG очищали за допомогою технологій іммобілізованої метал-афінної та афінної хроматографій. Питомий вихід очищеного препарату із клітинного супернатанту за оптимізованих умов складав 78,74% від загальної кількості рекомбінантного білку у клітині та становив 26,75 мг у розрахунку на 1 л культурального середовища.
Отже, нами було одержано рекомбінантний білок GST-HSV2gG ВПГ-2, підібрані оптимальні умови його експресії у клітинах E.coli та підтверджена можливість його застосування в діагностичній імуноферментній тест-системі.