УДК 616-006.04:577.122:612.014
O. Єфанова , О. Журавель, Ю. Юзефович, М. Солдаткіна, П. Погрібний
Дослідження ролі Бета-дефенсину-2 людини як регулятора клітинного циклу в моделі in vitro
Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології ім.Р.Є.Кавецького НАНУ, Київ
Дефенсини, мультифункціональні пептидні антибіотики, що віднесено до групи алармінів – білків-компонентів системи неспецифічного імунітету - є сигналами небезпеки для організму при інфекції, запаленні та злоякісній трансформації. В залежності від локальної концентрації дефенсини можуть мати про- чи анти-проліферативні ефекти на пухлинні клітини, викликати апоптоз та інгібувати деякі клітинні ферменти. В той же час механізм дії цих біомолекул на клітинному рівні залишається невстановленим. Метою нашого дослідження було встановити механізм впливу бета-дефенсину-2 людини (human beta-defensin-2 (hBD-2) на проліферативні властивості злоякісно трансформованих епітеліальних клітин людини. Матеріали та методи: Дослідження було проведено в моделі in vitro на 2-х клітинних лініях – аденокарциноми легені людини лінії А549 та епідермоїдної карциноми людини лінії А431 з використанням рекомбінантного hBD-2, експресованого в бактеріях у вигляді злитого білка hBD-2-GST. Вплив hBD-2 на швидкість клітинного поділу та на розподіл клітин по фазах клітинного циклу досліджували методами прямого підрахунку клітин та проточної цитометрії. Для аналізу внутришньоклітинної локалізації дефенсину застосовували конфокальну мікроскопію та імуноцитохімічний аналіз, а вплив hBD-2 на сигнальні каскади, залучені до регуляції клітинного циклу, досліджували методом Вестерн-блот-аналізу. Результати: Згідно отриманих даних, рекомбінантний hBD-2 має концентраційно залежний вплив на параметри росту культивованих клітин ліній A549 та A431 і викликає значне пригнічення проліферації клітин в діапазоні концентрацій від 100 нг/мл до 500 нг/мл (p<0.05). Із застосуванням проточної цитометрії нами було встановлено, що таке пригнічення росту пов’язане з арештом клітинного циклу у фазі G1/S. Методом Вестерн-блот аналізу було задетектована відсутність фосфорильованої форми pRB в клітинах, що інкубували з дефенсином, у порівнянні з контрольними клітинами. Дослідження внутришньоклітинної локалізації hBD-2 в клітинах лінії А549, інкубованих з hBD-2 протягом 48 годин, продемонструвало, що екзогенний дефенсин виявляється у цитоплазмі та значною мірою акумулюється в ядрі. Висновки: Результати нашого дослідження свідчать про те, що можливим механізмом дії бета-дефенсину-2 людини на культивовані епітеліальні клітини може бути hBD-2-залежний арешт клітин у фазі G1/S клітинного циклу.