Попередні семінари:

Шановні  колеги,  вітаю  Вас!  Хочу Вас проінформувати, що в Інституті
Шановні  колеги,  день добрий!  В Інституті
біохімії  ім.  О.В.Палладіна  НАН  України  продовжує свою роботу НАУКОВИЙ СЕМІНАР.
17-го грудня 2009 р.(Ч Е Т В Е Р !) о 10-30 ранку будемо слухати  доповідь
м.н.с. відділу біохімії коферментів ІБХ ЧОРНОГО Сергія Анатолійовича
"ВПЛИВ АНТАГОНІСТІВ ТІАМІНУ НА РЕАЛІЗАЦІЮ СИГНАЛЬНИХ  ПРОЦЕСІВ  АПОПТОЗУ  У  НЕРВОВИХ  КЛІТИНАХ".  Мова  йде  за апробацію кандидатської дисертації.  Авторські  тези  доповіді маєте у вигляді файлу, що додається. Запрошуємо Вас до участі у роботі нашого семінару.

З повагою - С.О.Костерін

Вплив антагоністів тіаміну на реалізацію 

сигнальних процесів апоптозу у нервових клітинах 

Чорний Сергій Анатолійович

м.н.с. відділу біохімії коферментів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

 Протягом останніх років вченими широко застосовуються різні моделі дефіциту тіаміну, викликаного застосуванням середовища інкубації без тіаміну або використанням антагоністів тіаміну, для досліджень, що мають сприяти науковому обґрунтуванню розробки нових терапевтичних технологій, зокрема у галузі лікування та профілактики нейродегенеративних захворювань. Актуальним є дослідження здатності окремих антагоністів тіаміну пригнічувати проліферацію ракових клітин, та перспектива їх використання у розробці нових фармакологічних агентів для боротьби з онкологічними хворобами. Проте на сьогоднішній день не існує повної картини наслідків, що спричинюються антагоністами тіаміну щодо сигнальних процесів у нервових клітинах. Детальне дослідження дозволить зрозуміти певні ключові позиції впливу антагоністів тіаміну на дані процеси. Метою роботи було дослідити механізми впливу антагоністів тіаміну на життєздатність субкультур нервових клітин та процесів, що ведуть до їх загибелі. В роботі були використані три класичні антагоністи тіаміну – окситіамін (ОТ), піритіамін (ПТ) та ампроліум (Ам). Робота проводилась на субкультурах ракових клітин щурів (нейронально-диференційовані клітини PC-12 та астроцитарні клітини DITNC) та людини (нейронально-диференційовані клітини SH-SY5Y та астроцитарні клітини 1321N1).  

У процесі виконання роботи були застосовані наступні методи: спектрофотометричний метод оцінки виживання клітин з використанням WST-1 реагенту (модифікація МТТ), конфокальна флуоресцентна мікроскопія, TUNEL аналіз, Western Blot, RT-PCR аналіз, atlas cDNA ARRAY аналіз. Окремі дослідження стану білку р53 проводили за допомогою методів ELISA та RT-PCR з використанням пасток до активного р53.

Вперше проведено загальний порівняльний аналіз впливу трьох різних за механізмом дії антагоністів тіаміну на життєздатність нервових клітини з різних організмів. Порівняльний аналіз дії антагоністів тіаміну на виживання нервових клітин дозволив виявити більш потужні з них та найбільш вразливі до дефіциту тіаміну клітинні культури. Було встановлено дозо- та часозалежну дію антагоністів тіаміну на нервові клітини. Нейронально диференційовані (н.д.) культури клітин виявились більш чутливими до дії антагоністів тіаміну, ніж астроцитарні.

Було встановлено, що під дією антагоністів тіаміну у клітинах відбувається вакуолізація клітинної мембрани, переміщення внутрішньомембранних фосфоліпідів на зовнішню поверхню мембрани, активація каспази 3, фрагментація ДНК, активація гену апоптоз-індукуючого фактора. Тобто, антагоністи тіаміну виявилися здатними викликати апоптоз у різних типах нервових клітин. У більшості дослідів ОТ та ПТ мали приблизно однаковий вплив на індукцію апоптозу у нервових клітинах. З усіх антагоністів ОТ мав найбльш потужний вплив на н.д. клітини SH-SY5Y, в той час як Ам взагалі показав найслабшу дію. Більший вплив Ам на н.д. клітини, ніж на астроцитарні, вказує на постійну потребу перших у надходженні тіаміну ззовні. Вперше було з’ясовано характер змін експресії ключових апоптичних факторів та інших білків і ферментів, що приймають участь в сигнальних процесах апоптозу, під впливом ОТ. Отримані дані відобразили загальну картину розвитку апоптозу у нервових клітинах після дії ОТ та допомогли зрозуміти, яким шляхом відбувається його індукція. Встановлено, що ОТ специфічно впливав на розвиток апоптозу через індукцію зростання експреcії генів багатьох апоптичних факторів (TFAR15, RhoA H12, CASP9, DAPK1 та інші), але не впливав на експресію генів окремих ключових апоптичних факторів (Rb, E2F, c-Myc та інші), хоча, у той же час призводив до 5-и кратного зростання експресії гену р53. Паралельно з цим спостерігалося зниження експресії генів інгібіторів апоптозу (IAP2 та IAP3), генів сімейства E2F білків та CDK. Вплив окситіаміну не спричинив підвищення експресії генів TNFR1 та TNFR2 з родини TNF, що вказує на рецептор-незалежні механізми розвитку апоптозу. Отримані дані можуть стати підгрунтям до формування гіпотези щодо централізованої ролі р53 у апоптозі, опосередкованому через дефіцит тіаміну.

Вперше досліджено стан білку р53 за умов індукції апоптозу, опосередкованого через дію антагоністів тіаміну. Було показано, що всі три антагоністи тіаміну сприяють підвищенню експресії гену транскрипційного фактора р53, його фосфорилюванню по Ser 9 та Ser 20 (апоптично активний стан р53), дефосфорилюванню по Ser 392 (стабільний стан р53), а також зв’язуванню з ДНК.

Наше дослідження підтвердило припущення щодо існування зворотнього зв’язку між активністю р53 та ТДФ (коферментна форма тіаміну). Було досліджено, що всі три антагоністи сприяли підвищенню експресії генів білків, які приймають участь в обміні і функціонуванні тіаміну (тіаміновий транспортер (THTR-1), піруватдегідрогеназа, ?-кетоглутаратдегідрогеназа та транскетолаза). Встановлено залежність між експресією генів кодуючих синтез ТДФ-залежних ферментів, THTR-1 та активним р53 у н.д. SH-SY5Y клітинах.

Таким чином, антагоністи тіаміну здатні викликати у нервових клітинах опосредекований через мітохондрії каспазо-залежний нерецепторний апоптоз, ключову роль у активації якого відіграє білок р53. Теоретичні положення, обговорені в роботі, і експериментальні  результати щодо особливостей дії антагоністів тіаміну на сигнальні процеси та ключові апоптичні фактори (p53, Rb, CASP9, DAPK-1, E2F та інші) в нервових клітинах, отриманих з різних видів організмів, можуть стати підгрунтям для розробки нових експериментальних моделей нейродегенеративних захворювань на клітинних культурах. Такі модельні дослідження створюють перспективу для пошуку нових протипухлинних засобів на основі антагоністів тіаміну.