Секція 3 Молекулярна біологія

УДК 577.218+616-006

І. Р. ГОРАК^{1, 2,} Г. В. ПАСІЧНИК¹, О.О. ПОВОРОЗНЮК^{1, 3}, А.A. САМОЙЛЕНКО¹,

Л. Б. ДРОБОТ¹
 НАДЕКСПРЕСІЯ АДАПТЕРНОГО ПРОТЕЇНУ RUK/CIN85 СУПРОВОДЖУЄТЬСЯ АКТИВАЦІЄЮ СИГНАЛЬНИХ ШЛЯХІВ, ЗАЛЕЖНИХ ВІД РІ3-КІНАЗИ ТА ТРАНСКРИПЦІЙНОГО ФАКТОРА NF-kB, У КЛІТИНАХ АДЕНОКАРЦИНОМИ МОЛОЧНОЇ ЗАЛОЗИ ЛЮДИНИ ЛІНІЇ MCF-7

 ¹Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ;

²Національний університет «Києво-Могилянська академія», Київ;

³Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ;

e-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам необхідно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

 Вступ. Молекулярною основою розвитку онкологічних захворювань є порушення функціонування окремих сигнальних шляхів, зокрема PI3K/Akt/mTOR та NF-kB, що супроводжується виникненням резистентності до хіміотерапевтичних та гормональних препаратів, порушенням регуляції процесів апоптозу та диференціювання клітин, посилення їх інвазивних властивостей. Раніше було показано, що клітини MCF-7 з надекспресією адаптерного протеїну Ruk/CIN85 характеризуються більшою стійкістю до аноїкісу, зростанням трансформувального потенціалу та резистентністю до лікарських засобів у порівнянні із клітинами дикого типу. Метою даної роботи було дослідити особливості функціонування залежних від РІ3К та транскрипційного фактора  NF-kB сигнальних шляхів у клітинах лінії MCF-7 з надекспресією Ruk/CIN85.

Методи. Особливості активації кіназ mTOR, ERK1/2, Akt, Src, IKK, інгібітора IkB та субодиниці р65 транскрипційного фактора NF-kB у відповідь на короткотривалі стимуляції клітин MCF-7 з надекспресією Ruk/CIN85 епідермальним фактором росту (EGF) досліджували Вестерн-блот аналізом. Активність NF-kB додатково аналізували з використанням репортерної системи з геном люциферази.

Результати. Виявлено, що клітини MCF-7 з надекспресією Ruk/CIN85 характеризуються конститутивною активацією сигнальних шляхів PI3K/Akt/mTOR та NF-kB, але не ERK1/2. Використання РР2, інгібітора нерецепторної кінази Src, продемонструвало Src-залежне фосфорилювання кінази Akt. Стимуляція клітин EGF зумовлює зростання рівня фосфорилювання кіназ ERK1/2, Akt, mTOR, Src, IKK, інгібітора IkB та субодиниці р65 транскрипційного фактора NFkB у клітинах з надекспресією Ruk/CIN85 у порівнянні з клітинами дикого типу. Відповідь таких клітин на стимуляцію досліджуваним фактором росту розвивалася раніше та тривала довше порівняно з контролем. Показано, що активність NF-kB, досліджена методом репортерної системи з геном люциферази, у клітинах дикого типу є достовірно нижчою, аніж у сублінії з надекспресією Ruk/CIN85.

Висновки. Отримані дані свідчать про те, щоRuk/CIN85 залучений до регулювання сигнальних шляхів PI3K/Akt/mTOR та NF-kB у клітинах аденокарциноми молочної залози людини лінії MCF-7.

УДК  577.164.1:616.155.3 + 616.379

M. GUZYK, A. TYKHOMYROV, G. DONCHENKO, T. KUCHMEROVSKA

PARP-1 INHIBITORS ALLEVIATE REACTIVE GLIOSIS IN RETINA OF DIABETIC RATS

Palladin Institute of Biochemistry of NAS of Ukraine, Kyiv, Ukraine

е-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам необхідно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

Introduction: Diabetic retinopathy (DR) is a multifactorial disease, and persistent hyperglycemia is known to be major contributor to its development. Reactive gliosis is a general response to injury and inflammation in retina and can be observed in numerous forms of retinal degeneration. It is characterized by up-regulation of various molecules, the best known of which is glial fibrillary acidic protein (GFAP). The exact molecular mechanisms contributing to development of diabetes-induced retinas neuropathy are not completely understood. The study was aimed to assess effects of Poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) inhibitors, 3-aminobenzamide (3-AB) and nicotinamide (NAm), on the extent of Poly(ADP-ribose)ylation and reactive gliosis in retina under diabetes.

Methods: All studies were performed after 10 weeks of diabetes (streptozotocin, 70 mg/kg of b.w., i. p.) in male Wistar rats treated 2 weeks with or without 3-AB (30 mg/kg/day, i. p.) and NAm (100 mg/kg/day, i. p.). Protein expression was measured by Western blot and immunohistochemistry.

Results: The levels of GFAP were significantly increased in retinas at diabetes as result of glial reactivity. In addition, expression of immunoreactive products of GFAP degradation (M_m 47-37 kDa), another representative indicator of reactive gliosis, was observed. Marked reduction of GFAP levels was seen in retinas of diabetic rats treated with 3-AB or NAm, though content of retinal GFAP did not reached to the control level. On the other hand, 3-AB and NAm administration completely prevented increase in GFAP degradation. Increased GFAP immunoreactivity was observed in retina sections of diabetic rats compared with control and supplementation of diabetic rats with PARP inhibitors counteracted glial activation in retinas. The latter is in parallel with data obtained by Western blot. Intensity of glial response appeared to be correlated directly with PARP-1 activation. Significant up-regulation of PARP-1 expression by about 1.5 in diabetic retinas compared to nondiabetic group was found. At the same time, PARP-1 fragmentation was exacerbated more than 2-fold in diabetic rats as compared to control. PARP-1 inhibitors administration to diabetic rats normalized PARP-1 expression in retinas. However, effect of NAm was more profound than 3-AB not only on protein expression but also on protection of PARP-1 against its fragmentation due to antioxidant property and improving of proinsulin biosynthesis through increase of NAD. Poly(ADP-ribosyl)ated proteins (pADPs) were detected primarily in range from 72 to 130 kDa, with several minor bands at 17 to 55 kDa. Both 72 to 130 kDa and 26 to 37 kDa pADPs expression was increased in diabetic rats as compared to control and was essentially prevented by 3-AB and NAm.

Summary: Thus, PARP-1 inhibitors can be potential drugs for treatment of DR through suppression of PARP-1 fragmentation, modulation of cytoskeletal protein expression and attenuation of glial reactivity.

УДК 571.27:004.9

О.І. КРИНІНА, Т.А. РЕДЧУК

ПРОГНОЗУВАННЯ Т-ЕПІТОПІВ АНТИГЕНІВ МІКОБАКТЕРІЙ INSILICOДЛЯ ОЦІНКИ МОЖЛИВОСТЕЙ ЇХ ВИКОРИСТАННЯ У СКЛАДІ ВАКЦИН ЧИ ДІАГНОСТИЧНИХ ТЕСТ-СИСТЕМ

Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ;

е-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам необхідно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

Туберкульоз – це інфекційне захворювання, що широко поширене по всьому світу. Ефективний контроль захворюваності на туберкульоз вимагає вдосконалення існуючих засобів діагностики цього захворювання. Також перспективним є створення новітніх вакцин для формування протективного імунітету у популяції на основі антигенів патогенних мікроорганізмів, які володіють високою імуногенністю та здатні зв’язуватись з різними молекулами генного комплексу HLA (англ. Human Leucocyte Antigens). Відбір білкових антигенів до складу діагностикумів та вакцин зазвичай базується на біохімічних та імунологічних дослідженнях, що потребують великих фінансових вкладень та часу. Наразі за допомогою різноманітних Інтернет-ресурсів та інструментів для вивчення взаємодій пептид‑МНС (англ. Major Histocompatibility Complex) in silico стало можливим суттєво скоротити кількість затраченого часу на пошук потенційних кандидатів для вакцин зменшивши кількість необхідних експериментів in vivo та in vitro.

Метою цієї роботи є порівняльний аналіз декількох найбільш досліджених антигенів Mycobacterium tuberculosis (MPT83, MPT63, ESAT-6, CFP10, SodA, leuD, panD, RD1 та HBHA) на предмет наявності Т-епітопів, що здатні зв’язуватись з декількома найбільш поширеними у східноєвропейській популяції алелями гену HLA.

Відбір алелей гену HLA здійнснювався за допомогою Інтернет-ресурсу Allele frequency net database, який містить відомості про частоти генів імунної системи та алелей, що їм відповідають, для різних демографічних популяцій. Прогнозування зв’язування антигенів мікобактерії з молекулами МНС класу ІІ проводили з використанням 4 онлайн-програм (Propred, RANKPEP, NetMHCIIpan та SMM‑align).

Для аналізу зв’язування антигенів M. tuberculosis з Т‑лімфоцитами було обрано 8 алелей гену HLA-DRB1, поширених на території Східної Європи. За допомогою 4 різних програмних засобів для кожного антигену було визначено сумарну кількість Т‑епітопів, що зв’язується з різними молекулами МНС класу ІІ.

Згідно отриманих in silico результатів можна зробити висновок, що найбільш імуногенними є білки SodA, MPT83 та leuD, для яких була знайдена найбільша кількість T‑епітопів серед досліджуваних алелей. Відповідно, ці антигени або їх комбінації є перспективними кандидатами для створення новітніх вакцин та діагностикумів з метою формування протитуберкульозного імунітету серед широкого кола жителів східноєвропейського регіону та з метою визначення стану захищеності популяції.

УДК  576.858

M.I. MAISTRENKO¹, Y.P. RUD², L.P. BUCHATSKY³

MOLECULAR CHARACTERIZATION OF INECTIOUS PANCREATIC NECROSIS VIRUS, “KARPATY” ISOLATE

¹Institute of High Technologies, Taras Shevchenko National University of Kyiv, Kyiv,

е-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам необхідно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.;

²Institute of Fisheries of the NAAS of Ukraine, Kyiv;

³ESC Institute of Biology, Taras Shevchenko National University of Kyiv, Kyiv

Infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) is the type species of the genus Аquabirnavirus familyBirnaviridae. IPNV is an agent of an acute, contagious fish disease causing high mortality not only in juvenile salmonids but also in non-salmonid fishes. In Ukraine the IPNVwas isolated from Siret river, Chernivtsi region, in 2013 and named as isolate “Karpaty”. Previously, Ukrainian isolate was investigated by cell culture and electron microscopy methods. But for more consistent statement of virus relationship, further establishing of possible origin and also developing rapid diagnostics the data of molecular characteristics is needed. Therefore the goals of present research were to study virus proteins, nucleotide sequences and phylogenetic analysis of  viral VP2 and NS genes.

The virus was propagated in RTG-2 cell line and purified by the method of ultracentrifugation. Viral proteins were studied in SDS-PAGE. Genomic viral RNA was extracted from cell culture fluid using GeneJET^TM RNA Purification Kit. The cDNA was synthesized using RevertAid^TM Premium First Strand cDNA Synthesis Kit and then subjected for PCR amplification. For extraction of DNA from agarose gel the Silica Bead DNA Extraction Kit was used. Sequencing was performed on a 3130 Genetic Analyzer and analyzed using BLASTN, Vector NTI 10 and MEGA version 5.2 software.

SDS-PAGE of purified virions revealed the presence of 4 polypeptides ranging from 28 to 90 kDa. The molecular weight of the major capsid protein VP2 was 57 kDa. The number of proteins and theirs molecular weight of virus isolate “Karpaty” were identical to reference Sp strains of IPNV.

Two sets of primers targeting full-length VP2 and partial NS genes were used for viral RNA amplification. Amplified fragments were in size of 1180 and 175 bp respectively. The nucleotide sequences of amplified fragments were analysed and the prevalance of Ukrainian isolate “Karpaty” to IPNV Sp strain was revealed. The comparison of sequences of  IPNVs VP2 and NS genes from NCBI and amplified fragments of isolate “Karpaty” confirmed the high identity of  97-99% with Sp strains found in Norway. The nucleotidesequence of VP2 gene was registered to GenBank under accession number of KJ596654.

УДК 576.08

 K. A. PYRSHEV, A. P. DEMCHENKO

LIPID REDISTRIBUTION IN THE OUTER PLASMA MEMBRANE LEAFLET DURING SUICIDAL DEATH OF ERYTHROCYTES AND HELA CELLS.

A.V. Palladin Institute of biochemistry of the NAS of Ukraine, Kyiv

Programmed cell death (PCD) is a very complex cellular phenomenon, the importance of which could be compared with division and proliferation (Elmore 2007). In suicidal programmed cell death of erythrocytes or eryptosis this process develops at the absence of the central apoptosis machinery, and it is thought that plasma membrane plays the most important role in this process. At the absence of mitochondrial depolarization and condensation of nuclei, erythrocytes share several other features of apoptosis, similar to death receptor pathway of nucleated cells. As a result, the loss of intracellular potassium, cell shrinkage, breakdown of phosphatidylserine plasma membrane asymmetry and blebbing are observed (Lang and Qadri 2012). However, erythrocytes share higher sensitivity to the most of PCD triggers (Lang, Qadri et al. 2012).

The aim of this research was to compare the properties of plasma membranes of nucleated cells and erythrocytes in the course of PCD.

In the present work, cellular studies were performed to validate and characterize the lipid order changes induced by PCD in outer plasma membrane leaflet of erythrocytes in comparison with that of nucleated cells. NR12S probe (Kucherak, Oncul et al. 2010; Darwich, Klymchenko et al. 2012) appeared to be useful approach for lipid order detection that allows avoiding the problem with haem (heme) group absorption at 405 nm. Experiments with HeLa cells showed the connection of NR12S response with caspase 3 activity and phospholipid exposure. In contrast, erythrocytes stained with NR12S did not display the difference in response between eryptotic and intact cells. However, cholesterol depletion in erythrocytes plasma membrane leads to the emission spectral shift of NR12S. This is at odds with other parameters characterizing erythrocytes’ involvement in PCD. Moreover, the microscopy data showed the increase of NR12S fluorescence intensity in the regions of forming blebs, suggesting the presence of lipid disorder domains in local parts of outer plasma membrane leaflet. It was demonstrated, that NR12S response caused by the loss of lipid order on apoptosis is probably connected with sphingomyelin hydrolysis and lipid scrambling, leading to a flux of sphingomyelin/ceramide from the outer to the inner leaflet. Thus, the lipid redistribution during PCD of erythrocytes is much less pronounced than in nucleated cells. It could be the result of lower expression of scramblase on the erythrocytes’ plasma membrane or of decreased scramlase-dependent flip-flop leading to retaining the lipid ordered structures and not significant hydratation dynamics in outer leaflet of plasma membrane.

УДК 577.3

Д.П. ПЛОДНІК¹,І.С. ВОЙТЕШЕНКО¹,  Д.М.ГОВОРУН^1,2

ГЕОМЕТРИЧНІ ТА ЕНЕРГЕТИЧНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОВНОГО СІМЕЙСТВа ПАР НУКЛЕОТИДНИХ ОСНОВ m⁹Ade⋅m¹Cyt: КВАНТОВО-ХІМІЧНИЙ АНАЛІЗ

¹Інститут високих технологій Київського національного університету

 імені Тараса Шевченка, Київ;

e-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам необхідно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

²Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ

Дослідження фізико-хімічних та енергетичних характеристик компонентів нуклеїнових кислот є важливою проблемою сучасної біофізики та біології. У представленій роботі квантово-хімічними методами проаналізовано геометричні та енергетичні характеристики повного сімейства пар нуклеотидних основ m⁹Ade ⋅ m¹Cyt.

Об’єктами дослідження обрано метильовані пари основ m⁹Ade ⋅m¹Cyt, у яких глікозидний атом гідрогену (Н) заміщено метильною групою у 9-му та 1-му положеннівідповідно. Предмет дослідження – вплив метилування на мутагенні властивості усіх можливих конформерів пар нуклеотидних основ.

Квантово-механічні розрахунки геометричної будови досліджуваних об’єктів проводили на рівні теорії DFTB3LYP/6-311++G(d,p) у вакуумному наближенні. Усі зоптимізовані структури перевірено на стійкість за відсутністю уявних частот у коливальних спектрах, розрахованих у гармонічному наближенні, на їхній основі оцінено відносну енергію Гіббса. Всі обчислення виконані за допомогою програмного пакету Gaussian 03 для платформи Win 32 (Frisch M.J. et al., 2004). Міжмолекулярні Н-зв’язки ідентифікували та досліджували методом аналізу топології електронної густини за допомогою програмного пакету АІМALL, використовуючи хвильові функції, отримані на рівні теорії B3LYP/6-311++G(d,p).

Вперше отримано повне конформаційне сімейство Н-зв’язаних пар основ m⁹Ade ⋅ m¹Cyt загальною кількістю 14 структур, у кожній із яких основи знаходяться у основній таутомерній формі. Виявлена множина пар знаходиться у енергетичних межах відносної енергії Гіббса від 0 до 10,90 ккал/моль. Найбільш енергетично вигідною серед них є пара основ, стабілізована двома водневими зв’язками N6H…N3 та N4H…N1з енергіями 6,37 і 6,94 ккал/моль відповідно.

Усі зафіксовані нами пари є  полярними  комплексами, дипольний момент яких лежить у межах від 3,9 до 11,0D. Серед них 3 структури – плоскосиметричні, решта 11 пар мають непланарну будову.

Також детально досліджено основні фізико-хімічні характеристики міжмолекулярних Н-зв’язків, що стабілізують пари. Загальна кількість Н-зв’язків складає 28, з-поміж них:  NH…N – 9, NH…O – 2, CH…N – 11, CH…O – 6 зв’язків. При цьому енергія Н-зв’язківлежить у межах 0,60 – 6,94 ккал/моль. У всіх досліджених парах спостережено по два Н-зв’язки.

Отримані результати, на думку авторів, корисні для експериментальної інтерпретації неканонічних пар нуклеотидних основ у структурі РНК та ДНК.

УДК 577.218+616-006

 ПОВОРОЗНЮКО.О.^1,2,ПАСІЧНИКГ.В.¹,ГОРАКІ.Р. ^1,3, БИЦЬН.В.¹ , ДРОБОТЛ.Б. ¹

НАДЕКСПРЕСІЯ АДАПТЕРНОГО ПРОТЕЇНУ RUK_l/CIN85 У КЛІТИНАХ АДЕНОКАРЦИНОМИ МОЛОЧНОЇ ЗАЛОЗИ ЛЮДИНИ ЛІНІЇ MCF-7 СУПРОВОДЖУЄТЬСЯ ПОСИЛЕННЯМ ПРОЯВУ ВЛАСТИВОСТЕЙ РАКОВИХ СТОВБУРОВИХ КЛІТИН

¹Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,  Київ;

²Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ;

³ Національний університет «Києво-Могилянська академія», Київ;

e-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам необхідно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

Виникнення та розвиток злоякісних пухлин пов'язані з функціонуванням ракових стовбурових клітин (CSCs). Проводиться великий об’єм робіт з дослідження молекулярних факторів, залучених до формування та підтримання фенотипу CSCs, проте вклад окремих адаптерних протеїнів залишається нез’ясованим. Відомо, що адаптерний протеїн Ruk/CIN85 виконує важливу роль не тільки у підтриманні гомеостазу нормальних клітин, але також залучений до регуляції шляхів злоякісної трансформації клітин.Метою роботи було оцінити роль адаптерного протеїну Ruk/CIN85 у прояві таких ознак ракових стовбурових клітин, як зниження проліферативного потенціалу та адгезивних властивостей, здатність до формування сфероїдів та експресія окремих поверхневих маркерів.

Дослідження проводили на клітинах аденокарциноми молочної залози людини лінії MCF-7 дикого типу та зі стабільною надекспресією адаптерного протеїну Ruk/CIN85. Показано, що надекспресія повнорозмірної форми адаптерного протеїну Ruk/CIN85 веде до зниження інтенсивності росту клітин, підвищення їх життєздатності на пізніх етапах культивування, збільшення кількості живих неприкріплених клітин та посилення здатності проліферувати у неприкріпленому стані у напіврідкому агарі. Встановлено також, що клітини зі стабільною надекспресією Ruk_l/CIN85 ефективніше формують мамосфери порівняно з контрольними клітинами. Відомо що ознакою ракових стовбурових клітин молочної залози є підвищена експресія поверхневого маркеру CD44 та знижена експресія CD24 на поверхні клітин. Методом протокової цитофлуориметрії виявлено достовірне збільшення кількості CD44⁺/CD24^- клітин для субліній з найвищим рівнем експресії досліджуваного протеїну.

Отримані дані свідчать про залучення адаптерного протеїну Ruk/CIN85 до прояву властивостей ракових стовбурових клітин.