УДК 543.424+577.27
А.О. БАХМАЧУК1, М.О. УСЕНКО1, О.Б. ГОРБАТЮК2, О.Е. РАЧКОВ2
ФОРМУВАННЯ БІОСЕЛЕКТИВНОГО ЕЛЕМЕНТА ІМУНОСЕНСОРА ПОВЕРХНЕВОГО ПЛАЗМОННОГО РЕЗОНАНСУ З ВИКОРИСТАННЯМ РЕКОМБІНАНТНОГО ПОВЕРХНЕВОГО БІЛКА А STAPHYLOCOCCUS AUREUS
1КНУ імені Тараса Шевченка, ННЦ «Інститут біології», Київ;
e-mail: a.bakhmachuk@gmail.com
2Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ
Вступ. Нагальною проблемою сучасного світу є розробка підходів та засобів аналітичної біотехнології, оскільки її успішне вирішення дасть змогу істотно покращити якість життя за рахунок удосконалення методів діагностики хвороб, контролю стану довкілля, якості харчових продуктів тощо. Використання різноманітних імунокомпонентів є дуже привабливим в даному напрямку досліджень. Однак при іммобілізації антитіл на поверхні біосенсорних перетворювачів їх антиген-зв’язувальна активність зазвичай значно знижується у порівнянні з активністю тих же антитіл у вільному стані. Головними причинами цього вважають стеричні обмеження та випадкову орієнтацію антитіл на сенсорній поверхні. Щоб запобігти цьому, можна було б створити проміжний шар, який включав би в себе імуноглобулін-зв’язувальні білки, наприклад, поверхневий білок AStaphylococcusaureus. Таким чином, мета даної роботи – дослідити можливість використання рекомбінантного білка А для іммобілізації компонентів біоселективного елемента імуносенсора.
Методи. Рекомбінантний поверхневий білок А Staphylococcusaureus з додатково введеним на С-кінці залишком цистеїну (SPA-Cys) було отримано синтезом в E.coli та очищено методом металoафінної хроматографії. Біологічну активність імунокомпонентів, що були використані в даному дослідженні, перевіряли імуноферментним аналізом. Дослідження міжмолекулярних взаємодій між імунокомпонентами виконували за допомогою протічної вимірювальної комірки спектрометра поверхневого плазмонного резонансу “Плазмон-4м”.
Результати. Було сконструйовано генно-інженерний рекомбінантний білок SPA-Cys, який містить п’ять імуноглобулін-зв’язувальних доменів білка А Staphylococcusaureus (E, D, A, B, C), послідовність олігогістидину (6His-tag) для його хроматографічної очистки та С-кіцевий залишок цистеїну. SPA-Cys отримано біосинтезом в E.coli в розчинній формі. Рекомбінантний SPA-Cys зберігав свої імуноглобулін-зв’язувальні властивості. Введення розчину SPA-Cys у вимірювальну комірку спектрометра поверхневого плазмонного резонансу “Плазмон-4м” з попередньо очищеною сенсорною поверхнею викликало відгук, що відповідає іммобілізації білка на рівню поверхневої густини іммобілізації 0,7 нг/мм2. Подальше блокування місць неспецифічної сорбції на сенсорній поверхні за допомогою білків молока дозволяло сформувати біоселективний елемент біосенсора, селективність якого перевіряли введенням у вимірювальну комірку різних білків.
Висновки. Сформований біоселективний елемент імуносенсора поверхневого плазмонного резонансу показує досить високу специфічність, чутливість детектування, стабільність та відтворюваність результатів.
УДК 579.222.2+579.26
ДІМОВА М.І., ВОЛЮВАЧ О.В., ГОРШКОВА О.Г., ІВАНИЦЯ А.В., СТЬОПІНА Т.О, ОСТАПЧУК Т.О, ПИСАРСЬКА М.М.
ЧУТЛИВІСТЬ НАФТООКИСНЮВАЛЬНИХ ШТАМІВ БАКТЕРІЙ РОДУ PSEUDOMONAS ДО АНТИБІОТИЧНИХ ПРЕПАРАТІВ
Одеський національний університет імені І.І. Мечникова, Одеса, Україна
e-mail:
Вступ. Вплив несприятливих чинників зовнішнього середовища на мікроорганізми сприяло формуванню у них універсальних механізмів захисту. Функціональні можливості захисних систем адаптації у мікроорганізмів біотехнологічного призначення небезмежні. А тому вони мають бути перевірені на чутливість до антибіотичних препаратів, що дозволить спрогнозувати їх нафтоокиснювальну здатність за екстремальних умов середовища. Об’єкти. В якості об’єктів дослідження використовували колекційні штами И-17Б11, И-17Б12, ТБМ роду Pseudomonas. Методи. Чутливість штамів мікроорганізмів до десяти антибіотичних препаратів, що належать до п’яти класів з різною хімічною будовою визначали диско-дифузійним методом. Результати. Встановлено, що із п’яти АБП: еритроміцин, олеандоміцин, неоміцин, левоміцетин (додатк. кл. хлорамфеніколи), тетрациклін, порушуючих синтез білка, найбільшою здатністю пригнічувати зріст мікроорганізмів були еритроміцин і олеандоміцин (II клас макроліди). Механізм їх дії пов'язаний з порушенням окремих процесів трансляції. Діаметр зон інгібування зросту мікроорганізмів (d) біля дисків, що містили по 15 мкг АБП коливався в межах від 33±2 до 40±1 мм. Найменшу резистентність по відношенню до тетрацикліну (IV кл. тетрацикліни) виявляв штам И-17Б12, для якого d =30±1. В молекулі стрептоміцину (III кл. аміноглікозиди) містяться два атакуючих глікозидних зв’язка, і, мабуть, тому, до нього порівняно з представником цього ж класу – неоміцином, штами И-17Б11, И-17Б12 і ТБМ були більш чутливими (d≥20 мм). Антибіотики аміноглікозиди зв’язуються зі специфічними білками-рецепторами на 30S субодиниці рибосом. Це призводить до порушення утворення ініціювального комплексу між матричною РНК і 30S субодиницею рибосоми. Внаслідок цього виникають дефекти при зчитані інформації з ДНК, синтезуються неповноцінні білки, що і призводить до зупинення розвитку мікробної клітини. Музейні мікроорганізми були малочутливими до лінкоміцину (додатк. кл. лінкозаміди) і виявляли нормальну чутливість до карбеніциліну (I кл. пеніциліни) та були резистентними до дії поліміксину (V кл. поліпептиди) - антибіотику, здатного порушувати молекулярну організацію і синтез клітинних мембран. Бета-лактамний АБП ампіцилін (I кл) не пригнічував біосинтез пептидогликанів клітинних стінок усіх досліджуваних бактерій, не інгібував ферменти транс- і карбоксипептидази і фузидину, мішенню якого є фактори елонгації, необхідні для синтезу білка. Висновок. Досліджувані мікроорганізми показали нормальну чутливість до АБП різних класів, а тому можуть бути успішно використані в екобіотехнології очищення води або грунту від нафти та нафтопродуктів.
УДК 543.555 + 543.635.22 + 543.635.24 + 577.152.1
О.Є. ДУДЧЕНКО1,2, В.М. ПЄШКОВА2, О.О. СОЛДАТКІН2, Г.М. БАБУРОВА1,
С.О. АНДРЕС3, С.В. ДЗЯДЕВИЧ1,2
ВИКОРИСТАННЯ СИЛІКАЛІТУ ДЛЯ ПОКРАЩЕННЯ АНАЛІТИЧНИХ ХАРАКТЕРИСТИК КОНДУКТОМЕТРИЧНОЇ БІОСЕНСОРНОЇ СИСТЕМИ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ ГЛЮКОЗИ ТА САХАРОЗИ
1Інститут високих технологій Київського національного університету ім. Тараса Шевченка, Київ
2Інститут молекулярної біології і генетики Національної академії наук України, Київ
3Національний університет «Києво-Могилянська академія», Київ
e-mail:
Глюкоза та сахароза є поширеними у природі речовинами, входять до раціону більшості населення Землі у складі продуктів харчування, використовуються у галузі виробництва ліків, а також у біотехнологічних процесах. Проте, разом з цим існує ряд обмежень до вживання цих речовин для пацієнтів з цукровим діабетом та рядом інших порушень обміну речовин, їм також необхідно контролювати рівень глюкози в крові. Тому на сьогодні потреба у точних, експресних, недорогих та технологічно нескладних методах визначення вуглеводів існує як у промисловості, так і у медицині. Біосенсорні технології пропонують точні методи кількісного і напівкількісного визначення речовин, але дозволяють спростити та здешевити цю процедуру, порівняно з сучасними високоточними аналітичними методами.
До складу кондуктометричного біосенсора, використаного у цій роботі, входив планарний фізичний перетворювач, який об’єднував дві пари зустрічно-гребінчастих електродів, одержаних методом вакуумного напилення золота на керамічну підкладку, а також дві мембрани: біологічно-розпізнавальна (ферментна), та порівняльна. Ферментна мембрана сахарозного біосенсора містила суміш інвертази, мутаротази та глюкозооксидази, а глюкозного біосенсора – лише глюкозооксидазу. Мембрана порівняння містила еквівалентну ферментам кількість бичачого сироваткового альбуміну. На частину датчиків попередньо наносили суспензію силікаліту та витримували при 180-200°С. Кожна з мембран іммобілізувалась на активній поверхні відповідної пари електродів методом поперечного зшивання глутаровим альдегідом, а кондуктометричні вимірювання проводились у диференційному режимі при 10 мВ вхідної напруги та частоті 40 кГц.
Оптимальним буферним розчином для роботи біосенсорів був обраний 5 мМ фосфатний буферний розчин (KH2PO4-Na2HPO4), pH 6.5. Лінійний діапазон виначення сахарози біосенсора, модифікованого силікалітом, становив від 0,01 мМ до 4,5 мМ сахарози, та від 0,005 мМ до 1,75 мМ глюкози. Лінійний діапазон виначення глюкози біосенсора для визначення глюкози, модифікованого силікалітом, складав від 0,005 до 2 мМ.
Модифіковані силікалітом ферментні кондуктометричні біосенсори для визначення сахарози та глюкози характеризувалися високою чутливістю, селективністю, відтворюваністю сигналу, та дещо ширшим лінійним діапазоном визначення сахарози та глюкози, порівняно з такими без використання силікаліту. Такі біосенсори в подальшому можуть бути застосовані у промисловій практиці з метою контролю рівня сахарози та глюкози.
УДК 616-006.6:57.083.3
Т. А. КАРПЕНКО1, А. И. БУРАКОВСКИЙ1, А. А. ЯСТРЕБОВА1, М. Н. ТИШКЕВИЧ1
ПРИНЦИПИАЛЬНЫЕ ПОДХОДЫ К РАЗРАБОТКЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА
1Институт биоорганической химии НАН Беларуси, Минск;
е-mail:
Вступление. В настоящее время определение уровня онкомаркеров широко используется в диагностике, лечении и контроле эффективности терапии онкологических заболеваний. Одним из объектов, активно изучаемых в последние годы,является уровень экспрессии в опухоли эпидермального фактора роста (ЭФР). Повышенный уровень ЭФР определен как компонент многих видов онкологических заболеваний (рак молочной железы, немелкоклеточный рак легкого, рак яичников и др.).
Методы. Разработан лабораторный вариант тест-системы по определениюЭФР в сыворотке крови человека в формате непрямого «сэндвич»-варианта иммуноферментного анализа.
Результаты.В качествекомпонентов разработанной ИФА тест-системы были выбранырекомбинантный человеческий ЭФР, моноклональные(МАТ) и поликлональные (ПАТ)антитела к ЭФР(«R&DSystems», Англия). Принцип метода основан на том, что анализируемое соединение (ЭФР), находящееся в сыворотке крови пациента, связывается во время инкубации с МАТ, предварительно иммобилизованными на внутренней поверхности лунок планшета для ИФА, с образованием иммунокомплекса. Несвязавшиеся компоненты удаляются путем отмывания планшета. На втором этапе к образовавшемуся иммунокомплексу «антиген-антитело» добавляют ПАТ, специфичные к другой антигенной детерминанте ЭФР, которые, связываясь, образуют «сэндвич»-иммунокомплекс. После удаления несвязавшихся компонентов на заключительном этапе в систему вводят меченные пероксидазой хрена антивидовыеполиклональные антитела, позволяющие детектировать ранее образовавшийся «сэндвич»-иммунокомплекс. Индикатором в этом тесте является хромогенный субстрат– 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин. Добавлением стоп-раствора (2N-ый раствор H2SO4) останавливают развитие цветной реакции и спектрофотометрически (450 нм) измеряют ее интенсивность, которая прямо пропорциональна концентрации исследуемого ЭФР в образце.Тест-система обладает следующими аналитическими характеристиками: чувствительность – 7,7 пг/мл; диапазон определяемых концентраций – 7-500 пг/мл; специфичность – ≥ 98%; время анализа – 4 ч.
Метод апробирован на модельных образцах (с известной концентрацией ЭФР) и на клиническом материале при онкопатологии различного генеза. Полученные результаты подтверждают соответствие данной тест-системы требованиям, предъявляемым к разработке аналогичных иммуноферментных методик.
Выводы. В перспективе разработанный метод может использоваться для ранней диагностики онкологических заболеваний, ассоциированных с гиперэкспрессией ЭФР, контроля эффективности проводимой терапии, динамического слежения за развитием патологического процесса и прогнозирования течения заболевания.
УДК 577.112:616
КРИВДЮК І.В., МІНЧЕНКО Д.О., ДАНІЛОВСЬКИЙ С.В., МІНЧЕНКО О.Г.
ЗМІНА РІВНЯ ЕКСПРЕСІЇ Тр53-ЗАЛЕЖНИХ ГЕНІВ У КЛІТИНАХ ЛГІОМИ ЗА УМОВИ ПРИГНІЧЕННЯ ФУНКЦІЇ СИГНАЛЬНОГО ЕНЗИМУ ERN1
Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ
e-mail:
Пригнічення ERN1 (від ендоплазматичного ретикулуму до ядра 1), основного сенсорно-сигнального ензиму стресу ендоплазматичного ретикулуму, призводить до зниження проліферації клітин гліоми і росту пухлин. Стрес ендоплазматичного ретикулуму є важливим фактором росту злоякісних пухлин, оскільки сигнальний шлях ERN1 тісно пов'язаний з процесами проліферації, апоптозу та виживання клітин. Гліоми є найбільш агресивними злоякісними пухлинами і ефективних підходів для боротьби з ними ще немає. Гіпоксія також сприяє посиленому росту гліоми, індукуючи адаптивні механізми підвищення життєздатності пухлинних клітин.
Метою роботи було дослідження експресії ТР53-залежних генів, зокрема, таких як TOPORS(topoisomeraseIbinding, arginine/serine-rich, E3 ubiquitinproteinligase), TP53BP1 (TP53bindingprotein 1), TP53BP2, SESN1 (sestrin 1 orTP53 regulatedPA26 nuclearprotein), NME6 (non-metastaticcells 6, відомий ще як NME/NM23 nucleosidediphosphatekinase 6),RYBP(RING1 andYY1-bindingprotein або DAD-associatedfactor) таZMAT3 (zincfinger, Matrin-type 3 або TP53 targetzincfingerprotein) у клітинах гліоми з пригніченою функцією сигнального ензиму ERN1 за умов гіпоксії.
Дослідження рівня експресії ТР53-залежних генів проведені на клітинах гліоми лінії U87, а також сублінії цих клітин з повним пригніченням функції сигнального ензиму ERN1 за допомогою кількісної полімеразної ланцюгової реакції. В експериментах з гіпоксією клітини поміщали у камеру з сумішшю газів: 3% О2, 5% СО2 та 92% N2.
Встановлено, що повне блокування функції генаERN1 у клітинах гліоми лінії U87 збільшує рівень експресії генів RYBP, TP53BP2та SESN1, але істотно знижує рівень експресії генівTP53BP1, TOPORS,NME6 та ZMAT3. Ці дані повністю узгоджуються з пригніченням проліферації клітин гліоми за умов блокування функції сигнального ензиму ERN1, оскільки зниження рівня експресії генівTP53BP1, TOPORS,NME6 та ZMAT3 сприяє посиленню апоптозу через стабілізацію p53 чи активацію його транскрипційної активності. В той же час, збільшення рівня експресії генів RYBP, TP53BP2та SESN1 призводить до стабілізації p53 шляхом інгібування його убіквітинації, а також посилення функції цього пухлинного супресора. Більше того, блокування функції сигнального ензиму ERN1 змінює характер гіпоксичної регуляції експресії цих генів. Так, гіпоксія істотно не впливає на рівень експресії генів TP53BP1 та SESN1 у контрольних клітинах гліоми, тоді як за умов пригнічення функції сигнального ензиму ERN1 рівень експресії цих генів збільшується. Крім того, величина індукованих гіпоксією змін в рівнях експресії генів RYBPта TP53BP2 є гено-специфічною і виражена більшою мірою для гена TP53BP2. Для гена TOPORSбуло показано, що рівень його експресії знижується в обох типах клітин гліоми за гіпоксії, причому блокування сигнального ензиму ERN1 посилює ефект гіпоксії.
Таким чином, експресія TP53-залежних генів контролюється ERN1-опосередкованою сигнальною системою стресу ендоплазматичного ретикулума як за нормальних, так і за гіпоксичних умов, і, можливо, приймає участь у пригніченні росту пухлин за умов виключення функції ERN1. Краще розуміння залежності пухлинних клітин від гіпоксії та стресу ендоплазматичного ретикулуму може сприяти пошуку нових терапевтичних стратегій, заснованих на блокуванні механізмів виживання клітин.
УДК 577. 336 + 577.113.7
M.V. KUPERMAN1,S.V. CHERNII1, V.B. KOVALSKA1, M.Yu. LOSYTSKYY1, D.V. KRYVOROTENKO1,
Yu.L. SLOMINSKI2, and S.M. YARMOLUK1
EFFECT OF N, N’- SUBSTITUTENTS ON SENSITIVITY OF CYANINE DYES AS PROBES FOR AMYLOID FIBRILS DETECTION.
1Institute of Molecular Biology and Genetics, NASU, 150 Zabolotnogo St., 03143 Kyiv, Ukraine; е-mail:
2Institute of Organic Chemistry, NASU, Murmans’ka Str. 5, 02094 Kyiv, Ukraine
Fluorescent probes identifying protein aggregates are of great interest, because the intra-cellular aggregate depositions are connected with pathogenesis of many devastating diseases, among them neurodegenerative disorders as such Parkinson and Alzheimer diseases. Despite of the wide use of fluorescence based assays for the study of amyloid formations, the very limited number of dyes (mainly Thioflavin T, Congo Red) are usually proposed for this aim. Earlier, we reported the mono- and trimethine cyanines as sensitive fluorescent probes for amyloid fibrils detection.
Here we present the study of fluorescent sensitivity of series of benzothiazole trimethine cyanines modified with different N,N’-substituents containing alkyl, hydroxyl, quarternary amine and phenyl groups to amyloid formations of human insulin and chicken egg lysozyme. Spectral-luminescent properties of the eight cyanine dyes were characterized in free state and in the presence of monomeric and fibrillar proteins. For the most sensitive dyes, the linear range of fibrillar insulin detection was estimated.
All studied cyanine dyes demonstrated low intrinsic fluorescence. The fluorescent excitation maxima for these dyes were in the range 547-560 nm, the fluorescent emission maxima were situated at 566-573 nm. These dyes were slightly sensitive to the presence of monomeric proteins, but increased their emission in 1.24-13 times in presence of insulin amyloid fibrils and in 2.1-25.8 times in presence of fibrillar lysozyme. Besides, the addition of fibrillar proteins results in bathochromic shifts of excitation and emission maxima of the dyes on 2-19 nm. It should be noted that dyes containing hydroxy groups in N-alkyl substituents are noticeably more sensitive to the presence of fibrillar lysozime, while the dyes modified with quaternary amine groups demonstrate higher fluorescent response in the presence of fibrillar insulin. Meso-methyl substituted benzothiazole trimethine cyanine dyes allow quantification of fibrillar proteins in the wide detection range – 0.8-300 mkg/ml for insulin and could be proposed for practical use as high efficient amyloid-sensitive fluorescent probes.
Since the nature of N,N’-substituent could determine the sensitivity of the dye to the fibrils of certain protein, we suggest the important role of these substituents in the complex formation between the dye molecule and amyloid structures.
УДК 577.21:631.523:604.6:664.012.1
Н. Б. НОВАК1,Р. В. ОБЛАП1,2, Т. М. ДИМАНЬ2
ЗАСТОСУВАННЯ МЕТОДУ ПЛР У РЕАЛЬНОМУ ЧАСІ (Real-TimePCR) ПРИ ОЦІНЦІ ДЕЯКИХ ПОКАЗНИКІВ ЯКОСТІ ТА БЕЗПЕКИ ХАРЧОВОЇ ПРОДУКЦІЇ
1 ДП «Укрметртестстандарт», Київ
е-mail:
2 Білоцерківський національний аграрний університет, Біла Церква
Однією з основних умов підтримки здоров'я нації в умовах підвищеного техногенного навантаження є якісне харчування. Разом з тим індустріалізація переробки сільсько-господарської сировини різко збільшила небезпеку хімічного та мікробіологічного забруднення харчової продукції, а це, в свою чергу, ставить під загрозу здоров'я людини. Тому сьогодні як ніколи є актуальним комплексний підхід щодо контролю якості харчової продукції на всіх етапах її виробництва. Своєчаснаоцінкаепізоотичноїситуації, проведення ефективних профілактичних заходів, використання сучасних методів діагностики, а також моніторинг біологічної безпеки на всіх етапах виробництва є основним критерієм одержання біологічно безпечної харчової продукції.
Метою роботи було створення, апробація та запуск у виробництво серії вітчизняних діагностичних тест-систем на основі методу ПЛР у реальному часі (ПЛР-РЧ, Real-Tіme PCR) для оцінки ряду показників якості та безпеки харчової продукції. У ході виконання роботи було відпрацьовано методологію використання досягнень сучасної біотехнології, зокрема ДНК-технологій, при оцінці якості та безпеки продуктів харчування та продовольчої сировини.
Було вивчено питання патогенетичної реакції глютену злакових культур (пшениці, жита, ячменю та вівсу) на організм людини, що призводить до порушень роботи органів травлення та розвиненню целіакії. Відпрацьовано підходи та розроблено діагностикум для якісного визначення вмісту глютену в харчовій продукції за використання технології TaqMan ПЛР-РЧ.
Проведено порівняльний аналіз молекулярно-генетичних та мікробіологічних методів діагностики харчових патогенів. Показано високу чутливість, специфічність і відтворюваність методу ПЛР-РЧ, а також значне скорочення часу проведення аналізу. Створено діагностикум для детекції Salmonellaspp., Shіgellaspp. і Lіsterіamonocytogenes в харчовій продукції.
Досліджено можливість застосування SYBR Green технології ПЛР-РЧ для якісної і кількісної оцінки вмісту молочнокислих і біфідобактерій у молочних продуктах та розроблено тест-систему для ідентифікації бактерій родів Lactobacіllus, Bіfіdobacterіum і Enterococcus.
Розроблені тест-системи проходять апробацію. Отримані на сьогоднішній день результати засвідчують доцільність використання діагностикумів на основі модифікацій методу ПЛР при випробуванні харчової продукції як самостійно, так і в поєднанні з іншими методами діагностики (бактеріологічними та імунологічними).
УДК 616.2 + 546.174
O.O. PARILOVA1, B.V. PYLYPCHAK2, S.G. SHANDRENKO1
SENSOR DEVICE DEVELOPMENT FOR NON-INVASIVE EXHALED BREATH ANALYSIS IN ASTHMA DISORDER
1Palladin Institute of Biochemistry of NAS of Ukraine, Kyiv;
2National Technical University of Ukraine «Kyiv Polytechnic Institute», Kyiv
Breath analysis is a powerful non-invasive technique for the diagnosis and monitoring of respiratory diseases. Elevated nitric oxide (NO) profile in exhaled breath is thought to be a marker of pulmonary inflammation. Exhaled NO is also directly associated with extent of untreated asthma and research has shown that it decreases with corticosteroid treatment. Fractional exhaled NO levels were shown to correlate with sputum eosinophil count, airway hyperresponsiveness, bronchodilator response, serum IgE levels, allergen skin prick testing, asthma symptoms, and lung function. These observations have generated significant interest in the clinical use of exhaled NO as a noninvasive marker to diagnose and monitor the progression of inflammatory process in the lungs during asthma.
The objective of the present study is to create a sensitive sensor system with an appropriate measurement range for detection of lung inflammation biochemical marker in the patients’ exhaled air under asthma exacerbation.
NO has a short half-life (in aqueous solution – 1 sec and in vivo - about 5 sec) and one unpaired electron, making it a free radical. Thus, a substantial part of exhaled NO combines readily with oxygen to form nitrogen dioxide (NO2). We assert, thatthis is the case, when measuring NO2 reflects the endogenic NO concentration produced in the lungs.
The experimental model of the device consisting of electrochemical gas sensor type NO2/C-20 (Membrapor) and 32-bit microprocessor module Triton 6000U for control and data acquisition with measurement accuracy ±10E-6 V was developed. The major activity of the designed sensor device is to transduce selective recognition of NO2 molecules in the form of electronic output signal, that is equal to - (1200 ± 200) nA/ppm. The electrochemical cell with resolution 0,1 ppm is equipped with three electrodes: a measuring-, a counter-, and a reference-electrode. The sensor has developed a reliable selective response on the model gas at the normal operating concentration (0 – 20) ppm, where the best linearity is found. The maximum exposure concentration of analyte is 200 ppm. T90 response time characteristic is defined as < 60 sec.
A baseline chart of sensor output signal was recorded. A typical curve demonstrating changes in peak height of voltage as a function of NO2 concentration was produced. This means, that analyte altered the interfacial properties of the electronic element, thus enabling the readout of the reaction by monitoring the performance of the electronic unit in the range (4 – 20) mA and the microprocessor module transformed it proportionally in voltage value.
The NO2 standards in the gaseous phase were prepared for measurement. The generation of NO2 is based on the ferrous sulfate method for nitrite ions («brown ring test») with the excessive aeration of the reaction volume. A definite amount of 40% NaNO2 solution was gradually added in the reaction mixture with equal volumes of 20% FeSO4 solution and concentrated H2SO4 acid (1:1) to achieve an expected concentration of NO2 in accordance with calculations taking into account an aeration flow rate and a generated pressure in a gas cylinder. The obtained gas was passed through 10% NaOH solution to trap impurity of hydrogen sulfide. The dilution of the gas mixture was produced for up to 4 bar by piston air compressor Ceccato OL195/24 with pumping capacity 180 l/min. Simultaneously concentration of synthesized NO2 was determined experimentally using Greiss technique adapted for gaseous state.
Thus, the experimental model of sensor device for NO2 gas detection has been constructed and tested. The obtained data give an incentive for further studies.
УДК 633.11:631.589
С. В. ПИКАЛО, С. І. ВОЛОЩУК
ВПЛИВ IN VITRO ХЛОРИСТОГО НАТРІЮ НА КАЛЮСОГЕНЕЗ ТА РЕГЕНЕРАЦІЮ РОСЛИН ТРИТИКАЛЕ ОЗИМОГО В КУЛЬТУРІ НЕЗРІЛИХ ЗАРОДКІВ
Миронівський інститут пшениці імені В.М. Ремесла НААН України
e-mail:
Вступ. Сьогодні все більше уваги приділяють пошуку шляхів використання поновлюваної енергії, накопиченої рослинами завдяки фотосинтезу. Тритикале є перспективною біоенергетичною культурою, зокрема для виробництва біоетанолу. Погіршення екологічної ситуації викликає необхідність поліпшення стійкості тритикале до абіотичних факторів, зокрема засолення ґрунтів. Селекція на солестійкість традиційними методами ускладнюється неможливістю створювати стресові фактори в польових умовах. Біотехнологічні методи дають можливість отримати рослини з бажаними ознаками. Селекція in vitro може вестися за ознаками, які можуть проявлятися на клітинному рівні, зокрема підвищену експресію певних генів – перемикачів метаболічних шляхів, які забезпечують толерантність до абіотичних факторів. Мета роботи – оцінити вплив хлористого натрію на калюсогенез та регенерацію рослин різних генотипів тритикале в культурі незрілих зародків.
Методи. Об’єктом дослідження слугували сорти тритикале озимого Обрій, АДМ 4 та гібрид F1 Обрій/АДМ 4. Незрілі зародки виділяли згідно з встановленою методикою, поміщали у чашки Петрі з поживним середовищем Мурасіге-Скуга. Після 4 тижнів ініціації калюсів в темряві за температури 25 оС проводили їх субкультивування на середовищі з додаванням різних концентрацій NaCl (0, 50, 100, 150 і 200 мМ) протягом 2 пасажів по 4 тижні. Для регенерації отримані калюсні культури субкультивували на половинному середовищі Мурасіге-Скуга з фітогормонами за освітлення та температури 22 оС. Враховували такі параметри як ефективність калюсогенезу та регенерації.
Результати. Присутність хлористого натрію в селективному середовищі проявляє депресивний вплив на індукцію калюсів і здатність їх до регенерації, причому тим більше, чим більшою була його концентрація. Порівняння середніх для кожної концентрації значень виявило, що за параметрами калюсогенезу і регенерації вплив був наступним: 0≈50>100>150>200 мМ NaCl. Слід відмітити, що за концентрації 200 мМ ефективність калюсогенезу складала 9,1-19,0 % (залежно від генотипу), а регенерація не спостерігалась взагалі. Для всіх концентрацій NaCl і параметрів вивчених генотипів встановлено, що їх середні значення перекриваються, однак для кожної концентрації порядок ранжування генотипів був наступним: Обрій > F1 > АДМ 4, що є підставою вважати сорт Обрій більш толерантним до дії хлористого натрію.
Висновки. Різна генотипова реакція на сольовий стрес в культурі незрілих зародків тритикале озимого проявлялась у різній здатності до калюсогенезу та регенерації рослин при дії хлористого натрію як селективного чинника. Відібрані генотипи можуть бути використані як цінний матеріал для подальшої селекції.
УДК 549.67+543.555+544.723+543.215.1
O. Y. SAIAPINA1, A. WALCARIUS2, N. JAFFREZIC-RENAULF3, S. V. DZYADEVYCH1,4
Investigation of the ammoniumIONS ADsORPTION ON clinoptilolite for the material application as A SELECTIVE ELEMENT in the conductometric sensors
1Institute of Molecular Biology and Genetics, NAS of Ukraine, Kyiv
е-mail:
2University Henri Poincare Nancy 1, Villers-les-Nancy, France
3University Claude Bernard Lyon 1, Villeurbanne, France
4Institute of High Technologies, Taras Shevchenko Kyiv National University, Kyiv
Increase in the ammonium concentrations in the water systems causes a significant environmental and economic concern nowadays. Often it is a result of the insufficient ammonium removal from the industrial wastewaters and the municipal sewages. Moreover, the ammonium inflow to the surface and ground waters can originate from other sources. These include but not limited to the land-applied manure and biosolids, the septic systems, the animal feedlot runoff, the land-applied fertilizers, the manure storage structures, the fertilizer facilities. Therefore, the necessity in the direct, highly sensitive and accurate, low-cost and fast methods of the ammonium determination in the aqueous systems is well-observed and the appropriate methods still need to be reviewed or developed. This work was aimed to study the ammonium-selective properties of the natural zeolite clinoptilolite (CLT) and its applicability for the conductometric determination of ammonium in a differential mode of measurements.
A powdered sample of CLT of the Romanian origin (ZN-C1BF-R zeolite from Mediterranean Society of Zeolites, France) was taken for investigation. Its unit cell formula was (Na0.10K0.57)(Ca0.47Mg0.15)(Al1.97Fe0.12)(Si9.96Ti0.02)O24×7H2O; the average size of particles was 0.4 μm; the crystals had the monoclinicform with platelets of 10–20 nm thick.
The sensitivity of CLT to the ammonium ions was studied in the ultra-pure water (water resistivity was no less than 18.2 MΩ×cm) with NH4+ and Na+ ions in the concentration range of 0.01–1 mMof each; the aqueous solutions of K+, Na+, Ca2+, Mg2+ and Al3+ ions (in concentration of 5 mM of each), the buffer solutions as well as the buffer solutions with the increasing concentrations of the above mentions ions. Coefficients of selectivity were calculated by Fixed Interference Method. The sensitivity of a pair of electrodes which were not modified with CLT was studied in 5 mM Na2HPO4-KH2PO4 solution, 5 mM Tris-HCl, and 5 mM HEPES-NaOH buffer solutions.
Sorption of ammonium by zeolite was found based on the comparison of conductivities of the CLT-containing phosphate buffer solution, the CLT-containing phosphate buffer solution with the increasing concentrations of ammonium and the phosphate buffer solution with the increasing concentrations of ammonium (in the absence of zeolite). The conductivity variations were compared for the aqueous solutions of NH4+ and Na+ ions and for the former solutions but in the presence of CLT. It was found that the conductivity growth for the CLT-containing solution at the ammonium concentrations of 0.01 mM, 0.1 mM, 0.5 mM and 1 mM was 4.6%, 651.5%, 195.9% and 146.9% respectively.
It was shown the sufficient selectivity of CLT toward ammonium which allows its further detection in the complex media using the conductometric sensors with the differential mode of measurements. The development and optimization of the clinoptilolite-based conductometric microsensor for ammonium determination is ahead.
УДК 579.264
СУСЛОВА Т. В., СЛОБОДЯНИК О. С.
АНТАГОНІСТИЧНА АКТИВНІСТЬ ШТАМІВ ЛАКТОБАЦИЛ ПО ВІДНОШЕННЮ ДО УМОВНО-ПАТОГЕНнИХ ТА САПРОФІТНИХ БАКТЕРІЙ після тривалого зберігання
Одеський національний університет імені І.І. Мечникова, Одеса, Україна
е-mail:
Вступ. При розробці пробіотичних препаратів велике значення має пригнічення розвитку умовно-патогенних бактерій. Актуальним є створення пробіотичних препаратів на основі індигенних бактерій. Штами бактерій, що виділені з шлунково-кишкового тракту людей, що мешкають в даній місцевості, мають виявляти більш виразний терапевтичний ефект, ніж колекційні та штами, вилучені в інших регіонах. Об’єкти.В якості об’єктів дослідження використовували 8 штамів бактерій роду Lactobacillus, вилучених з фекалій дітей віком 3-7 років, що мешкають в Одеській області. Штами лактобацил зберігалися методом ліофілізації 14 років.Методи. Антоганістичну активність лактобацил по відношенню до 6 колекційних штамів умовно-патогених та сапрофітних штамів Escherichiacoli, Bacillussubtilus, Pseudomonasaeruginosa, Proteusvulgaris, Staphylococcusaureus, Micrococcusluteusвизначали методом агарових блоків.
Результати. Встановлено, що по відношенню до E. coli і B. subtilus більшість штамів молочнокислих бактерій антагоністичну активність не проявляли або проявляли дуже слабко. Відсутність антагоністичної активності по відношенню до кишкової палички можна розцінювати як позитивний факт. Є підстави вважати, що використання в подальшому досліджуваних штамів бактерій, як основи пробіотичних препаратів не буде супроводжуватися порушенням складу нормальної мікробіоти кишечника. Половина штамів бактерій роду Lactobacillusпригнічували рістP. aeruginosa, P. vulgaris, S. aureus. Для встановлення природи антагоністичної активності лактобацил, була проведена модифікація досліду з додаванням в середовище культивування каталази для нейтралізації для перекису водню, що продукується лактобацилами і з карбонатом кальцію для нейтралізації дії основного метаболіту лактобацил – молочної кислоти. Показники антагоністичної активності вилучених штамів знизилось не значно, що свідчить про не дуже важливу роль перекису водню в пригніченні мікробіоти, з якою конкурують лактобацили. Під час досліду з карбонатом кальцію, доданому у середовище для нейтралізації дії молочної кислоти, зони затримки росту індикаторних штамів не спостерігались, що свідчить про те, що дослідженні штами лактобацил не продукують речовини з бактеріцидною дією. Висновок.Молочна кислота та інші органічні кислоти, які продукуються дослідженими штамами гомо- та гетероферметативними молочнокислих бактерій відіграють домінуючу роль у пригніченні росту умовно-патогенних та сапрофітних бактерій.
УДК 577.336+667.287.4
CHERNII S.V.1, KOVALSKA V.B.1, LOSYTSKYY M.Yu.1, CHEREPANOV V.V.2,
CHERNII V.Ya.3, TRETYAKOVA I.M.3, YARMOLUK S.M.1
PHTHALOCYANINES WITH OUT-OF-PLANEQUINOLINIUM STYRYL LIGAND AS INHIBITORS OF INSULIN AMILOID FIBRILS FORMATION
1Institute of Molecular Biology and Genetics, NAS of Ukraine, 150 Zabolotnogo St., Kyiv 03143, Ukraine,
е-mailchernii.sv
2Institute of Physics, NAS of Ukraine, 46 Nauky Ave., Kyiv 03680, Ukraine
3 Institute of General and Inorganic Chemistry, NAS of Ukraine, 32/34 Palladin Ave., Kyiv 03680, Ukraine
The pathogenesis of many diseases, including neurodegeneration and amyloidoses is connected with formation by involved proteins of the β-folded stable insoluble aggregates called amyloid fibrils. A number of compounds that belong to different chemical classes are known as inhibitors of this process. Previously we have shown that zirconium and hafnium phthalocyanines with different out-of-plane substitutes demonstrated the high efficiency of inhibition of fibrils formation.
The goal of this work is to investigate the Hf and Zr phthalocyanines with axially-coordinated quinoline styryl dye as potential inhibitors of insulin fibril formation. Reactions of fibril formation were performed by incubating the insulinsolution in a water bath at 65 °C for about 5 h (concentration of protein was 340 М, that of inhibitor was 100 µM). Dose-dependent inhibition of insulin fibrils formation by Zr and Hf phthalocyanines was performed using 0, 0.1, 0.5, 2, 10 or 100 µM concentration of inhibitors. The inhibition was monitored by fluorescence intensity changes of the amyloid-sensitive dye 7519. The inhibitory activity was calculated as (1-І/І0)´100%, where І0 and I are 7519 fluorescence intensity values in control sample and in the presence of inhibitor respectively.
Phthalocyanines with Zr and Hf as central metal demonstrated the same high inhibitory activity of about »90% and similar values of IC50 equal to 0.16±0.08 mM and 0.11±0.04 mM, respectively. The suppression of fibril formation induced by Hf phthalocyanine was confirmed by atomic force microscopy (AFM). It should be noted that previously we reported the ability of axially-coordinated phthalocyanines to redirect the insulin aggregation process toward the formation of oligomeric or amorphous aggregates, while in the presence of Hf phthalocyanine amyloid fibrils of characteristic diameter (about 6 nm) and proto-filamentous species of smaller diameter were detected as the main product of aggregation reaction.
Thus, we propose that the studied compounds are high-efficient inhibitors of protein amyloid fibril formation. We suppose that the nature of the central metal slightly affects the inhibitory properties of axially-coordinated phthalocyanines, while out-of-plane ligands could play an important role for anti-fibrillogenic activity of these macrocyclic complexes.
This work was supported by STCU – NASU (grant 5972).
УДК 615.375
Т.О. ЧУДІНА, О.І. КРИНІНА, К.Ю. МАНОЙЛОВ, Н.В. КОРОТКЕВИЧ, А.Ю. ЛАБИНЦЕВ
АД’ЮВАНТНІ ВЛАСТИВОСТІ НАНОЧАСТОК РІЗНОГО РОЗМІРУ ТА ХІМІЧНОЇ БУДОВИ З ІММОБІЛІЗОВАНИМ РЕКОМБІНАНТНИМ ФРАГМЕНТОМ ДИФТЕРІЙНОГО ТОКСИНУ ПРИ ІМУНІЗАЦІЇ PER OS
Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ
е-mail:
Більшість бактеріальних патогенів потрапляють в організм через слизові оболонки, а отже імунна відповідь в слизових є визначальним захисним фактором. Поглиблення знань щодо особливостей розвитку імунної відповіді у слизових відкриває нові можливості для розробки пероральних вакцин, які матимуть локальний імуностимулюючий ефект в слизових. При розробці таких вакцин найбільш важливими проблемами є вибір способу доставки антигену, захист антигенного матеріалу від дії пошкоджуючих факторів внутрішнього середовища організму та вибір безпечних ад’ювантів для підсилення імунної відповіді в слизових. Головним фактором патогенності збудника дифтерії є дифтерійний токсин, який продукується бактерією в місцях колонізації на слизових оболонках дихальних шляхів. Отже індукція потужного антитоксичного імунітету в слизових потенційно здатна захистити організм від інфекції.
Метою цієї роботи було порівняння ад’ювантних властивостей наночасток різної хімічної природи на основі фосфату кальцію (САР) розміром 37 нм, колоїдного золота (GoldI та GoldII) розмірами 9 та16 нм і полілактид-ко-гліколіду (PLGA I та PLGA II) розмірами 35 та 100 нм відповідно, кон’югованих з рекомбінантним фрагментом дифтерійного токсину, шляхом визначення концентрацій антитіл IgA та IgG у периферичній крові мишей.
Дослідження проводили на мишах-самках BALB/с з однаковими віком та вагою, яких імунізували peros з розрахунку 250 мкг протеїну на 1 кг маси тіла три рази з періодичністю в два тижні. Сироватки для аналізу вмісту антитіл збирали через тиждень після кожної імунізації.
Було показано, що концентрації антитіл IgA у крові, порівняно з контролем, помітно збільшились вже після другої імунізації у груп мишей, які отримували антиген, кон’югований з носіями PLGA I та PLGA II, а також GoldII. У групі мишей, що отримували PLGA II, відмічено також збільшення концентрацій IgG у крові після третьої вакцинації.
З огляду на результати досліду можна зробити висновок, що наночастки PLGA I, PLGA II та GoldII мають найкращу здатність стимулювати імунну відповідь на іммобілізований на них антиген за умов його перорального введення. Це дозволяє розглядати їх в якості можливих носіїв для створення пероральної форми доставки вакцинних препаратів.
УДК 57.085.23:577.11
1Т.А. ЮРЧУК, 1Е.В. КИРОШКА,1В.В. КИРОШКА,2В.А. ПЕТРОВА, 3Д.Д.ЧЕРНЯКОВ,
2,3Ю.А. СКОРИК
ОСОБЕННОСТИ РОСТА КЛЕТОК INVITROНА БИОПОЛИМЕРНЫХ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ МАТРИЦАХ РАЗЛИЧНОЙ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ
1Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков;
е-mail:
2 Институт высокомолекулярных соединений РАН, Санкт-Петербург.
3Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия, Россия
В настоящее время биополимерные внеклеточные матрицы (БВМ) в таких областях современной биотехнологии, как тканевая и клеточная инженерия показали свою эффективность при формировании тканевых и клеточных структур как in vitro, так и in vivo. Природныеполисахариды и композиты на их основе являются перспективными материалами для создания таких матриц. БВМ создают микроокружение, которое является одним из ключевых факторов, определяющим адгезию клеток, скорость их пролиферации и функциональные характеристики.
Цель данной работы – исследовать характер адгезии клеток, их морфологию и динамику пролиферации культуры эпителиоподобных клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) в условиях культивирования на БВМ хитозана (БВМ-1) и его композитов с нановолокнами хитина (БВМ-2), гиалуроновой кислотой (БВМ-3), и альгинатом натрия (БВМ-4).
Адгезию клеток изучали стандартным методом подсчета количества неприкрепившихся клеток к субстрату через 24 часа после посева клеток. Морфологию клеток при распластывании оценивали микроскопически на 1, 3 и 5-е сутки культивирования. Скорость пролиферации культуры определяли как отношение количества клеток, снятых через 1, 3 и 5 суток культивирования, к количеству посеянных.
Показано, что индекс адгезии клеток на БВМ-1 и БВМ-2 составлял 74,2 и 62,5%, что достоверно не отличается от такового показателя при культивировании на пластике (76,2%). При использовании БВМ-3 и БВМ-4 индекс адгезии клеток достоверно снижался до 49,6 и 53,3 %, соответственно. При этом характер распластывания клеток и их морфология имели качественные отличия в зависимости от физико-химической структуры БВМ. Так, в условиях культивировании на пластике наблюдалось формирование монослоя, состоящего из клеток веретеновидной формы, тогда как при использовании БВМ клетки имели округлую, сферическую форму, которая впоследствии приводила к образованию пространственных трехмерных структур, состоящих из плотно организованных конгломератов. Следует отметить, что динамика пролиферации культуры клеток на пластике и на БВМ-2 была сопоставима между собой, тогда как скорость роста клеток на БВМ-1 снижалась в 2 раза. Использование БВМ-3 и БВМ-4 уменьшало скорость пролиферации клеток в 4-6 раз, что, по-видимому, связано с избыточным отрицательным зарядом на поверхности данных матриц.
Таким образом, характер адгезии клеток, их морфология и динамика пролиферации в условиях культивирования на БВМ на основе хитозана и его композитов определяются физико-химической структурой БВМ.
УДК 616-097:612.346:57.083.3
ЯСТРЕБОВА А.А., БУРАКОВСКИЙ А.И., ТИШКЕВИЧ М.Н., КАРПЕНКО Т.А.
АНТИТЕЛА К ДЕКАРБОКСИЛАЗЕ ГЛЮТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ – ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ МАРКЕР АУТОИММУНОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ β-КЛЕТОК ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Институт биоорганической химии НАН Беларуси, Минск
е-mail:
Сахарный диабет 1 типа (СД1) – метаболическое заболевание, характеризующееся гипергликемией, в основе которого лежит повреждение β-клеток, приводящее к абсолютному дефициту инсулина. В ответ на выраженную деструкцию плазматические клетки секретируют аутоантитела к различным антигенам β-клеток, которые рассматриваются как иммунологические маркеры аутоиммунного повреждения. В последние годы внимание многих исследователей привлечено к аутоантителам к декарбоксилазе глютаминовой кислоты (АТ-ДГК). Во время асимптоматического развития диабета АТ-ДГК могут детектироваться у пациента за 5-7 лет до клинических проявлений болезни, которые возникают только после гибели не менее 80% инсулинсекретирующих клеток.
Определение концентрации АТ-ДГК в сыворотке крови человека позволяет: диагностировать начальные стадии поражения поджелудочной железы и СД1; предоставляет исследователям точный количественный критерий для оценки и контроля степени выраженности патологического процесса, эффективности проводимой терапии и прогнозирования развития болезни; дает возможность дифференцировать сахарный диабет 1 и 2 типа; а также проводить скрининг родственников (недиабетиков) и выявлять группы риска в отношении СД1. Также немаловажным является возможность оценки степени аутоиммунного воспаления при недиабетической патологии (АТ-ДГК выступает как один из цитологических маркеров аутоиммунного процесса).
К сожалению, в большинстве случаев СД1 диагностируется в клинической стадии, когда уже разрушено 80–90% β-клеток поджелудочной железы. Своевременно установленный диагноз СД1 у пациента предотвращает бурное прогрессирование заболевания и дает возможность назначения своевременных и адекватных лечебных мероприятий, что предотвращает или снижает вероятность развития тяжелых осложнений болезни.
Поэтому проблема идентификации и количественной детекции АТ-ДГК с высоким уровнем чувствительности и специфичности приобретает особую актуальность.
На базе лаборатории медицинского микроанализа Института биоорганической химии НАН Беларуси разработан высокочувствительный метод в формате непрямого твердофазного иммуноферментного анализа для количественной оценки концентрации АТ-ДГК в сыворотке крови, который обладает следующими аналитическими характеристиками: чувствительность – 0,3 МЕ/мл; диапазон определяемых концентраций – 0-50 МЕ/мл; специфичность – не менее 98%; коэффициент вариации – не более 10 %; тест на «открытие» – 85-115 %; время постановки анализа – 2,5 часа. Данный метод позволяет проводить раннюю диагностику СД1, который представляет одну из важнейших медико-социальных проблем во всем мире.