Артем Тихомиров (д-р біол. наук, заступник директора з наукової роботи)
Тези
ЕФЕКТИВНЕ ВИКОРИСТАННЯ ЕКСПРЕСІЇ РЕКОМБІНАНТНИХ ГЕНІВ ІЗ ДОСЛІДНИЦЬКОЮ ТА БІОТЕХНОЛОГІЧНОЮ МЕТОЮ
E-mail:
Різноманітні варіанти тимчасової та постійної експресії рекомбінантних генів та їх продуктів, зокрема, протеїнових, стали рутинною практикою сучасної біомедицини в останні 40 років. Метою даного виступу є аналіз стратегії оптимального вибору методичного підходу залежно від поставленого біомедичного завдання, зокрема буде розглянуто аденовірусний підхід в поєднанні із cDNA chip-аналізом, а також створення експресійних систем в бактеріях та модельних рослинах.
Тимчасова експресія в клітинах ссавців найчастіше використовується із дослідницькою метою. За допомогою методів молекулярного клонування із наступною тимчасовою експресією отриманих конструктів, нами проведено дослідження транскрипційної регуляції гена інгібітора диференціації типу (Id1). Доказано, що ген Id1 є прямим геном-мішенню сигнального шляху морфогенетичних протеїнів кістки (Bone morphogenetic proteins, BMP) та його внутрішньоклітинних транскрипційних посередників протеїнів Smad. Проведено аналіз in silico послідовності промоторної ділянки гена Id1 і шляхом створення бібліотеки делеційних та серії ділянко-скерованих мутантних конструкцій для люциферазних репортерних дослідів доведено, що регуляторні ділянки GTCT/AGAC та паліндром GGCGCC є важливими для транскрипційної активації гена Id1. За допомогою методу EMSA показано безпосереднє специфічне зв’язування ядерних BMP-активованих протеїнів Smad із Р35-мічених олігонуклеотидів, що містять досліджувані регуляторні ділянки. Переконливим доказом прямого зв’язування регуляторних ділянок GTCT/AGAC та паліндрому GGCGCC протеїнами Smad стало використання з цією метою продукованих в E.coli рекомбінантних Smad4 тa MH1-Smad5. На підставі проведеного методом тимчасової експресії аналізу транскрипційної активації гена Id1 сигнальним шляхом BMP/Smad cконструйовано високочутливу та високоспецифічну синтетичну конструкцію BRE-Luc [Korchynskyi & ten Dijke’2002], яка стала основою для створення трансгенних BMP-репортерних мишей з метою моніторингу активації сигнального шляху BMP/Smad in vivo [Monteiro’2004].
Суттєвим обмеженням методу тимчасової експресії є неможливість досягнення за його допомогою 100% ефективності трансдукції клітин-мішеней. Для досягнення гомогенної популяції трансгенних клітин розроблено методи постійної експресії та підходи із використанням рекомбінантних вірусів. Використання підходу аденовірусної інфекції клітин-мішеней дозволило нам досягнути 100% доставки конституційно активованих протеїнів Activin-like kinases (ALK2/3/6) з метою стимуляції сигнального шляху BMP/Smad [Korchynskyi et al.’2004]. Такий підхід мав на меті пошук потенційних специфічних генів-мішеней для кожного з означених протеїнів. В підсумку: високоефективна експресія за допомогою аденовірусного підходу в поєднанні із cDNA chip-аналізом створила нам можливість виявлення низки нових генів-мішеней сигнального шляху BMP/Smad, таких як транскрипційні фактори HesR1(↑), ICSBP(↑) та ITF-2(↓), репресор Slug(↑), проапоптичні гени DRP-1 death kinase(↓) та ZIP kinase(↓), IĸBα(↑), ZO-1(↓), рецептори LPA Edg-1(↑) і Edg-2(↑) та E3 ligase Dactylin(↓) [Korchynskyi et al.’2004].
Триваюча останні 12 років агресія росії проти України, що переросла останні 4,5 року в повномасштабну війну, створила надзвичайно високу потребу в легкодоступних і високоефективних кровоспинних засобах. Велике зацікавлення привертають до себе інноваційні підходи до створення новітніх кровоспинних засобів, основою яких, зокрема, є рекомбінантні активатори протромбіну. Для створення рекомбінантного активатора зсідання крові було обрано ензимний активатор зсідання крові екарин змії Echis carinatus, який має одноланцюгову будову та високу прокоагулянтну активність. Створено плазмідні конструкції, що кодують протеїновий активатор зсідання крові для експресії: в бактеріях E.coli і ембріональних клітинах нирок людини лінії НЕК293. Виконано дослідження з вивчення прокоагулянтної активності рекомбінантного протеїнового активатора зсідання крові за умов його поєднання з біоматеріалами для надання їм кровоспинних властивостей та показано високу ефективність препарату, що продукувався в експресійній системі клітин людини. Рекомбінантний екарин, що продукувався в постійній індуцибельній експресійній системі E.coli, виявився токсичним для бактерій, а тому більш ніж 99% рекомбінантного протеїну депонувалося ними у вигляді тілець включення. Після денатурації інкапсульованого бактерійного протеїну екарину та його наступного рефолдингу, його питома активність виявилась нижчою від такої активності препарату в експресійній системі клітин ссавців. З метою отримання дешевого і легкодоступного високоактивного препарату рекомбінантного екарину у співпраці із Інститутом клітинної біології та генетичної інженерії НАН України створено гетерологічну систему для його експресії шляхом транзієнтної експресії у рослинах виду Nicotiana benthamiana – найпоширенішого продуцента рекомбінантних протеїнів. Використання векторних конструкцій з генетичними елементами патогенних рослинних вірусів дало нам змогу отримати у рослинах високі рівні продукції фізіологічно активного рекомбінантного протеїну екарину. Подано патентну заявку для інтелектуального захисту створеної системи продукції рекомбінантного екарину.
Висновок: раціональний вибір та поєднання різних підходів тимчасової та постійної експресії рекомбінантних генів дозволяє успішно досягати мети в широкому спектрі біомедичних завдань, як чисто дослідницьких, так і прикладних.