ТІАКАЛІКС[4]АРЕНИ – ПРОТЕКТОРИ АТР-ГІДРОЛАЗНОЇ АКТИВНОСТІ МІОЗИНУ МІОМЕТРІЯ ВІД ВПЛИВУ КАТІОНІВ ВАЖКИХ МЕТАЛІВ

Шановні коллеги, вітаю Вас! 16 червня (середа) 2021 р. об 11:00 у Конференц-залі Інституту відбудеться розширене засідання колективу відділу біохімії ліпідів, присвячене апробації кандидатської дисертації Яворовської Вікторії Ігорівни (відділ біохімії м'язів). Тема  доповіді: «ТІАКАЛІКС[4]АРЕНИ – ПРОТЕКТОРИ АТР-ГІДРОЛАЗНОЇ АКТИВНОСТІ МІОЗИНУ МІОМЕТРІЯ ВІД ВПЛИВУ КАТІОНІВ ВАЖКИХ МЕТАЛІВ». Тези доповіді додаються до цього листа.

Головувати на засіданні буде в.о.зав. відділу біохімії ліпідів к.б.н. Косякова Г.В.

Запрошуємо до участі у роботі семінару усіх бажаючих.

Увага! Участь у роботі семінару можлива виключно за умов користування захисними масками та взаємодистанційного перебування слухачів у залі. Дякую за розуміння !

З повагою – С.О.Костерін.

ТЕЗИ ДОПОВІДІ

Тіакалікс[4]арени – протектори АТР-гідролазної активності міозину міометрія від впливу катіонів важких металів.

Доповідач: Яворовська Вікторія Ігорівна.

Науковий керівник: Костерін С.О., академік НАН України, доктор біологічних наук, професор.

Актуальність теми: Міометрій серед інших гладеньких м'язів відіграє виняткову роль внаслідок його унікальних функцій в репродуктивній системі жіночого організму у зв'язку з вагітністю та пологами. Порушення скоротливої функції міометрія викликає різноманітні патології у вагітних жінок: слабкість пологової діяльності, передчасні пологи та викидні. Здатність міометрія до скорочення визначається взаємодією двох основних скоротливих протеїнів актину та міозину, що утворюють актоміозиновий комплекс. Процес гідролізу АТР міозином лежить в основі скоротливої функції міометрія, тому забезпечення енергетичних потреб клітин гладеньких м'язів є надзвичайно важливим. Значну роль в забезпеченні клітин енергією у формі АТР відіграють мітохондрії завдяки процесу окисного метаболізму.

Важкі метали — велика група речовин, що забруднюють довкілля, серед них Pb та Cd є одними з найбільш токсичних. Цi елементи — дуже шкiдливi для органiзму людини навіть у малiй кiлькостi. Особлива токсичність Pb та Cd, пов'язана з їх здатністю накопичуватись в органах та тканинах, оскiльки органiзм людини не має ефективних механiзмiв їх виведення. Важкі метали здатні викликати різноманітні порушення репродуктивної системи жінок, які призводять до безпліддя, затримки статевого дозрівання, викликають гормональні порушення та онкологічні захворювання статевої системи .

Катіони важких здатні викликати зниження ензематичної активності актоміозинового комплексу та АТР-гідролазної активності міозину міометрія. Катioни Cd і Pb також викликають порушення функціонування електрон-транспортувального ланцюга клітини, що призводить до зниження рівня утворення АТР мітохондріями. Пiд їх впливом значно посилюється утворення активних форм кисню у клітинах, що призводить до окислювального стресу в клітинах та значною мірою пов'язано із токсичнicтю Cd²⁺ та Pb²⁺.

З огляду на значну кількість порушень в організмі жінок, які викликані впливом важких металів важливим є пошук та розробка фармакологічних сполук, які можуть усувати їх токсичний вплив. До таких потенційних сполук належать каліксарени та їх сульфурвмісні похідні тіакаліксарени. Вони можуть утворювати міцні комплекси з катіонами двовалентних металів завдяки щільно розміщеним на нижньому вінці макроциклу гідроксильним групам та атомам двовалентного сульфуру. Вони здатні селективно та ефективно зв’язувати катіони важких металів та сприяти їх виведенню з організму. Це робить тіакаліксарени перспективними для розробки лікарських засобів для усування токсичних впливів важких металів в організмі.

Завдяки своїм властивостям утворювати супрамолекулярні комплекси з широким колом речовин каліксарени та їх похідні також є перспективними для розробки флуоресцентних хемосенсорів до катіонів різних металів.

Мета роботи: дослідити можливі захисні властивості тіакалікс[4]аренів при шкідливих впливах катіонів важких металів - Cd, Pb, Zn та Ni на АТР-гідролазну активність міозину та функціонування дихального ланцюга мітохондрій клітин міометрія.

Головні задачі:

1. Вивчити захисні властивості тіакалікс[4]аренів від негативного впливу катіонів важких металів на АТР-гідролазну активність субфрагмента-1 міозину.
2. Дослідити захисний вплив тіакалікс[4]аренів на біохімічні показники функціонування дихального ланцюга мітохондрій міоцитiв за дії катіонів ВМ.
3. З’ясувати механізми взаємодії тіакалікс[4]аренів із катіонами Zn, а також можливості застосування цих сполук в якості внутрішньоклітинних флуоресцентних зондів до Zn²⁺.

Методи дослідження: ультрацентрифугування, вертикальний електрофорез в поліакриламідному гелі, колонкова хроматографія, світлова мікроскопія, конфокальна флуоресцентна мікроскопія, протокова цитофлуориметрія, культура клітин еукаріотів, МТТ-тест, ензимологічні, спектрофотометрія, спектрофлуориметрія, комп’ютерне моделювання, докінг-аналіз, біохімічна кінетика та статистичний аналіз.

Основні результати: Визначена ензиматична активність АТРази актоміозину за умов впливу катіонів Cd, Pb, Zn і Ni. Виявлено, що катіони цих металів інгібують АТРазну активність субфрагмента-1 міозину міометрія: катіони Pb (300 мкМ) інгібували АТР-гідролазу міозину на 88% , катіони Cd (300 мкМ) на 56%, катіони Ni (300 мкМ) на 30% та катіони Zn²⁺  (5 мМ) на 43%.

Зроблено припущення, що катіони Cd та Pb можуть зв’язуватися у функціонально важливих дiлянках субфрагмента-1, що сприяють зв'язуванню та гідролізу АТР, а катіони Ni та Zn, за досить значних концентрацiй здатні заміщувати Mg²⁺ у активному центрі міозину.

Встановлено, що тіакалікс[4]арен С-800 (100 мкМ) ефективно відновлював активність АТРази міозину за дії Pb²⁺, Cd²⁺, Zn²⁺ та Ni²⁺. Найбiльш iмовiрно, що механiзм захисного впливу тiaкалікс[4]арену С-800 базується на його здатностi хелатувати катіони цих металів із середовища інкубації за допомогою гiдроксильних груп та атомiв двохвалентного сульфуру на нижньому вiнцi макроциклу. На підставі даних, отриманих за допомогою методу комп'ютерного докінгу було також зроблено припущення, що тiaкалікс[4]арени можуть «вiдтягувати» катioни важких металів з їх сайтiв зв'язування у субфрагментi - 1 мioзину.

З'ясовано вплив катіонів важких металів на енергетичне забезпечення клітин міометрія. Для цього була досліджена здатність Cd²⁺, Pb²⁺ та Zn²⁺ впливати на дихальний ланцюг мітохондрій клітин міометрія. З цією метою вивчалась здатність клітин міометрію відновлювати водорозчинні солі тетразолію (МТТ реагенту) до нерозчинних кристалів формазану за впливу катіонів Cd, Pb та Zn. Було встановлено, що катіони Cd та Pb посилюють утворення формазану клітинами міометрія приблизно в 2 рази за концентрацї близько 1 мМ. Зроблено припущення, що його посилене утворення клiтинами гладенького м'язу матки може бути пов'язаним з порушенням функцiонування сукцинатдегідрогенази та НАДН-дегiдрогеназного комплексу мiтохондрiй за впливу катіонів Cd та Pb. При додаваннi тіакалікс[4]арену С-800 iнтенсивнiсть вiдновлення МТТ реагенту міоцитами матки пiд впливом Cd тa Pb знижувалась та поверталась до контрольного рiвня. Це може пояснюватися, як зв'язуванням цих кaтioнiв з середовища iнкубації тіакалікс[4]ареном С-800, так і всередині клiтин мioметрiя.

Для встановлення впливу Cd²⁺, Pb²⁺, Сa²⁺, Mg²⁺ та Zn²⁺ на функціонування комплексів І та ІІ дихального ланцюга було досліджено їх дію на рівень автофлуоресценції нікотинамідних та флавінових коферементів ізольованих мітохондрій гладенького м'язу матки. При дослiдженнi автофлуоресценцiї НАДН в iзольованих мiтохондрiях міометрія щура було встановлено, що пiсля їх iнкубації протягом 5 хв з катiонами Cd та Pb (1 мМ) вона зростала приблизно в 2,5 та 1,5 раза вiдповiдно. Автофлуоресценцiя НАДН в iзольованих мiтохондрiях також посилювалась пiд впливом Ca²⁺ та Zn²⁺  (1 мМ) на 50% та 25% відповідно, але вона не змінювалась за дії Mg²⁺ (1 мМ). При дослiдженнi автофлуоресценцiї ФАД⁺ в iзольованих мiтохондрiях міометрія щура було показано, що вона зростала приблизно в 2 рази рази пiсля їх iнкубації протягом 5 хв з катiонами Cd (1 мМ) та майже не змiнювалась пiд впливом Pb²⁺ (1 мМ). Вона також не змiнювалась за дії Mg²⁺, Ca²⁺ та Zn²⁺  (1 мМ).

Досліджувалась також здатність катіонів Cd, Pb та Zn впливати на інтенсивність утворення активних форм кисню клітинами гладенького м'язу матки. Показано, що пiд впливом Cd²⁺ та Pb²⁺ (1 мМ) протягом 5 хв відбувалось посилення утворення активних форм кисню на 50%. В той час, як катіони Zn (1 мМ) майже не впливали на їх утворення клітинами міометрія. Додавання тіакалікс[4]арену С-800 (100 мкМ) в середовище інкубації клітин міометрія з катіонами Сd не призводило до зниження продукування активних форм кисню міоцитами.

При дослідженні флуоресцентних властивостей комплексів важких металів та тіакалікс[4]аренів, виявлена можливість використання тіакалікс[4]арену С-800 в якостi селективного та чутливого флуоресцентного зонда для Zn²⁺ в живих клітинах.

Практичне значення одержаних результатів: Результати, що були одержані, перспективні для подальшого розглядання використання тіакалікс[4]аренів в якості хелатуючих агентів в медицині. Особливо, беручи до уваги відносну нешкідливість та низьку імуногенність каліксаренів.

З'ясована можливість застосування тіакалікс[4]арену С-800 в якості чутливого та селективного флуоресцентного зонда до Zn²⁺, що може мати значення для подальших досліджень ефектів цього катіону в живих клітинах оскільки катіони Zn мають важливе значення для забезпечення життедіяльності клітин та організму людини. Більше того, катіони Zn шкідливі у надлишковій кількості, тому моніторинг вмісту цих іонів в клітині може мати важливе практичне та теоретичне значення.