КАЛІКС[4]АРЕНИ ЯК СЕЛЕКТИВНІ ТА АФІННІ ІНГІБІТОРИ Mg2+,ATP-ЗАЛЕЖНИХ КАТІОН-ТРАНСПОРТУВАЛЬНИХ ЕЛЕКТРОЕНЗИМІВ ГЛАДЕНЬКОМ’ЯЗОВИХ КЛІТИН

Шановні колеги! Науковий семінар Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України «Актуальні проблеми сучасної біохімії» продовжує свою діяльність. 11-го червня (вівторок) 2019 р. о 10-30 в Актовій залі Інституту будемо слухати доповідь ст. наук. співр. відділу біохімії м’язів ІБХ НАН України ВЕКЛІЧ  Тетяни Олександрівни «КАЛІКС[4]АРЕНИ ЯК СЕЛЕКТИВНІ ТА АФІННІ ІНГІБІТОРИ Mg²⁺,ATP-ЗАЛЕЖНИХ КАТІОН-ТРАНСПОРТУВАЛЬНИХ ЕЛЕКТРОЕНЗИМІВ ГЛАДЕНЬКОМ’ЯЗОВИХ КЛІТИН». Як завжди, до інформаційного листа додаємо авторські тези доповіді. Запрошуємо Вас та Ваших колег до участі у роботі семінару.

З повагою – С.О.Костерін

ТЕЗИ НАУКОВОЇ ДОПОВІДІ

«КАЛІКС[4]АРЕНИ ЯК СЕЛЕКТИВНІ ТА АФІННІ ІНГІБІТОРИ Mg²⁺,ATP-ЗАЛЕЖНИХ

КАТІОН-ТРАНСПОРТУВАЛЬНИХ ЕЛЕКТРОЕНЗИМІВ

ГЛАДЕНЬКОМ’ЯЗОВИХ КЛІТИН»

В Е К Л І Ч  Тетяна Олександрівна,

с.н.с. відділу біохімії м’язів ІБХ ім. О.В. Палладіна НАН України

 Іон кальцію є важливим внутрішньоклітинним месенджером, і саме під контролем Са²⁺-залежних сигнальних шляхів реалізуються більшість біохімічних та фізіологічних процесів: скорочення м’язів (скелетних, гладеньких, міокарду), запліднення, проліферація, секреція, нейротрансмісія, клітинний ріст, а також апоптоз та некроз. Гладенькі м`язи відіграють важливу роль у забезпеченні  функціонування внутрішніх органів та систем органів. Для здійснення процесів скорочення-розслаблення гладеньких м`язів, зокрема, міометрія, необхідно, щоб рівень цитоплазматичного Са²⁺ у міоплазмі динамічно та оборотно змінювався в діапазоні концентрацій від наближено 100 нМ (стан спокою, релаксація механічної напруги) до 1 мкМ (скорочення). Порушення Са²⁺-залежної скоротливої функції міометрія у жінок часто стає причиною різноманітних патологій: слабкості пологової діяльності, спонтанних абортів, передчасних пологів, викидней, атонії, гіпо- і гіпертонусу матки. Проте, незважаючи на значну кількість експериментальних біохімічних та біофізичних робіт, присвячених дослідженню внутрішньоклітинних кальцієвих сигналів в міометрії, маємо вельми обмежені дані щодо механізмів підтримання фізіологічно значущої концентрації іонів Са та її спрямованої регуляції у міоцитах матки в нормі та за патологічних станів.

Важливу роль у забезпеченні контроля скорочення - розслаблення м’язових клітин, у тому числі гладеньком’язових, відіграють мембранозв’язані Mg²⁺,АТР-залежні Са²⁺-транспортувальні та Na⁺,K⁺-транспортувальні електроензими – електрогенні іонні помпи.

Активність електрогенних транспортних систем залежить не тільки від  концентрації  іонів та субстрату, але і від мембранного потенціалу та стехіометрії іонного обміну. Відповідно, транспортна АТРаза, яка генерує електричний струм і активність якої змінюється в залежності від мембранного потенціалу, є електроензимом. Тому актуальним є пошук сполук, які були б селективними та достатньо афінними ефекторами цих помп, що здатні модифікувати Са²⁺-залежну скоротливу функцію міометрія у випадку її порушення за вищезазначених патологічних станів і водночас були б нетоксичними для організму. У цьому аспекті, зокрема, являють інтерес каліксарени – чашоподібні макроциклічні сполуки, які одержують шляхом циклоконденсації пара-заміщених фенолів і формальдегіду. Попередні літературні дані вказували на те, що вибрані калікс[4]арени можуть утворювати комплекси з АТР, але на час початку виконання цієї роботи були відсутні результати щодо використання зазначених сполук як ефекторів катіон-залежного ензиматичного та неензиматичного гідролізу цього нуклеозидтрифосфату.

Мета наукової доповіді – представити, систематизувати та проаналізувати власні експериментальні результати щодо біохімічних та фізико-хімічних механізмів дії калікс[4]аренів на електроензими - катіон-транспортувальні АТР-гідролазні системи гладеньком’язових клітин матки, а також на неензиматичний гідроліз АТР.

При виконанні досліджень були використані методи препаративної та  аналітичної біохімії, біохімічної мембранології, ензимології, спектрофотометрії, спектрофлуориметрії, протокової цитофлуориметрії, лазерної-кореляційної спектроскопії, світлової та електронної мікроскопії, конфокальної мікроскопії, кондуктометрії, тензометрії, комп`ютерного моделювання, молекулярної динаміки та докінг-аналізу, хімічної та біохімічної кінетики, математичного моделювання, а також статистичного аналізу. Калікс[4]арени були синтезовані та охарактеризовані методами ЯМР та інфрачервоної спектроскопії під керівництвом акад. НАН України В.І.Кальченка (ІОХ НАН України).

У доповіді буде акцентовано увагу на наступних експериментальних даних.

Вперше наведено докази використання калікс[4]аренових платформ як ефективних регуляторів активності електроензимів мембран клітин гладенького м’язу матки - Mg²⁺,АТР-залежної Са²⁺-помпи та Na⁺,K⁺-помпи.

Mg²⁺,АТР-залежна Са²⁺-транспортувальна помпа плазматичної мембрани та калікс[4]арени. Ця помпа безпосередньо використовує енергію гідролізу АТР для електрогенного викиду іонів Са з цитоплазми у позаклітинний простір. Із залученням методу лазерної-кореляційної спектроскопії було встановлено, що калікс[4]арен С-107 взаємодіє з везикулами плазматичних мембран міоцитів міометрія і викликає агрегацію мембранних везикул між собою або з мікрочастинками калікс[4]арену. Продемонстровано, що калікс[4]арен С-107 може вбудовуватись в плазматичну мембрану і проникати через неї. Вперше показано, що калікс[4]арен С-90 селективно (не впливає на активність інших АТР-гідролаз на рівні плазматичної мембрани) дозозалежно інгібує активність транспортувальної Са²⁺,Mg²⁺-АТРази і препарату очищеної солюбілізованої Са²⁺,Mg²⁺-АТРази, коефіцієнти інгібування І_0,5 складають 20,2 ± 0,5 і 34,6 ± 6,4 мкМ відповідно. Структурний фрагмент калікс[4]арену С-150 (суто «калікс[4]аренова чаша») та модельна сполука М-1 (у складі молекули калікс[4]арену С-90 маємо 4 фрагменти М-1) незначно пригнічують Са²⁺,Mg²⁺-АТРазну активність плазматичних мембран. Ефективність інгібування Са²⁺,Mg²⁺-АТРази калікс[4]аренами залежить від кількості та взаємного розташування фенілсульфониламідинових груп на верхньому вінці «калікс[4]аренової чаші». Модифікація нижнього вінця калікс[4]аренової «чаші» двома октанольними залишками (калікс[4]арен С-956) на додаток до двох залишків пропанолу (калікс[4]арен С-90) призводить до збільшення ефективності інгібування активності Са²⁺,Mg²⁺-АТРази плазматичної мембрани. Доведено, що калікс[4]арен С-90 діє як повний неконкурентний інгібітор Са²⁺,Mg²⁺-АТРази плазматичної мембрани, так як він не впливає на коефіцієнти активації для іонів Са та Mg, уявну константу Міхаеліса К_m за АТР, але у всіх випадках дозозалежно зменшує максимальну початкову швидкість V_max реакції гідролізу АТР.

Із використанням методу Са²⁺-чутливої спектрофлуориметрії було встановлено, що під дією калік[4]арену С-90 пригнічується Mg²⁺,АТР-залежна акумуляція іонів Са у везикулах плазматичних мембран міоцитів матки. Результати математичного моделювання передбачили, що за цих умов калікс[4]арен С-90 має збільшувати концентрацію Са²⁺ в незбуджених міоцитах, що й було підтверджено експериментально з використанням методу Са²⁺-чутливої флуоресцентної конфокальної мікроскопії. За допомогою методу лазерної-кореляційної спектроскопії  показано, що калік[4]арен С-90 зменшує гідродинамічний діаметр міоцитів міометрія.

У співпраці з к.б.н. О.В.Цимбалюк (ІВТ КНУ імені Тараса Шевченка) було встановлено, що калікс[4]арен С-90 на 20 % пригнічує швидкість релаксації м`язевого скорочення, нормованну на амплітуду скоротливої відповіді (у випадку реєстрації спонтанної активності смужок міометрія). Ця сполука також збільшує швидкість скорочення міометрія у відповідь на стимуляцію цього процесу утеротоніком окситоцином. Ці дані цілком знаходяться у відповідності з вищенаведеними біохімічними результатами.

Отже, нами знайдено селективний (на рівні плазматичної мембрани) низькомолекулярний вельми афінний (І_0,5 = 20 – 30 мкМ) інгібітор Mg²⁺,АТР-залежного Са²⁺-транспортувального електроензиму - калікс[4]арен С-90.

Як виявилося, калікс[4]арен С-90 з меншою ефективністю пригнічує також активність Са²⁺-помпи саркоплазматичного ретикулуму (І_0,5 = 56 мкМ), ніж активність Са²⁺-помпи Са²⁺,Mg²⁺-АТРази плазматичної мембрани (І_0,5 = 20 мкМ). Втім, в нещодавних дослідах ми продемонстрували, що новий тіакалікс[4]арен С-1087 – близький аналог калікс[4]арену С-90, також селективно (як і С-90), але значно більш ефективно гальмує Mg²⁺,АТР-залежний Са²⁺-транспортувальний електроензим плазматичної мембрани, проте суттєво слабкіше (ніж С-90) пригнічує активність Са²⁺-помпи ретикулуму.  

Mg²⁺,АТР-залежна Na⁺,K⁺-транспортувальна помпа плазматичної мембрани та калікс[4]арени. Ця помпа безпосередньо використовує енергію гідролізу АТР для здійснення трансмембранного 3Na⁺-2K⁺ електрогенного обміну одновалентних катіонів; у свою чергу енергія натрієвого градієту використовується для забезпечення активного Na⁺-залежного антипортного транспорту іонів Са (Na⁺-Ca²⁺ обмін). Вперше встановлено, що калікс[4]арени С-97, С-99 та С-107 селективно та значно ефективніше ніж уабаїн, пригнічують активність Mg²⁺,АТР-залежного Na⁺,K⁺-транспортувального електроензиму - Na⁺,K⁺-АТРази (значення уявних коефіцієнтів інгібування становить 33+4 нМ, 98+8 нМ, 54+6 нМ та 21+5 мкМ відповідно для  калікс[4]аренів С-97, С-99, С-107 та уабаїну). Детально вивчено кінетичні властивості дії зазначених калікс[4]аренів на активність натрієвої помпи. Було доведено, що ефективність інгібування цього ензиму під дією калікс[4]аренів залежить від взаємного розташування амінофосфонових групп та від модифікації верхнього та нижнього вінця молекули калікс[4]арену. Калікс[4]арени С-97 та С-107  не впливають на коефіцієнт активації для іонів Mg, уявну константу Міхаеліса К_m за АТР, але зменшують спорідненість Na⁺,K⁺-АТРази до іонів Na.

Неензиматичний гідроліз АТР та калікс[4]арени. Показано, що деякі калік[4]арени (С-107, С-91 та С-106) можуть стимулювати неензиматичний гідроліз АТР, який протікає вельми повільно, характеризується низькою спорідненістю калікс[4]аренів до АТР та складною кінетикою реакції гідролізу: крива цього процесу не підпорядковується закономірностям реакцій низьких порядків (нульового, першого) і є негіперболічною (у часі). Детально вивчено кінетичні та каталітичні властивості реакції неензиматичного калікс[4]ареніндукованого гідролізу АТР (на прикладі калік[4]арену С-107). З одержаних даних однозначно випливає, що причиною ефективної інгібуючої дії досліджених калікс[4]аренів на активність транспортувальних електроензимів (див. вище) не може бути тривіальне утворення комплексу «калікс[4]арен-АТР».

Висновок. У науково-теоретичному (фундаментальному) аспекті одержані результати є суттєвими для розуміння біохімічних та фізико-хімічних властивостей транспортувальних електроензимів - Са²⁺- та Na⁺,K⁺-транспортувальних Mg²⁺,АТРазних систем плазматичної мембрани і саркоплазматичного ретикулуму гладеньком’язових клітин, та механізмів спрямованої регуляції функціональної активності цих систем. Вони поглиблюють відомості стосовно іонних, молекулярних та мембранних механізмів внутрішньоклітинного кальцієвого обміну в гладеньких м’язах, зокрема, щодо ролі плазматичної мембрани у забезпеченні електро- та фармакомеханічного спряження в них. В практичному аспекті одержані результати свідчать на користь того, що вибрані калікс[4]арени можуть бути успішно використані в лабораторній практиці як селективні афінні інгібітори Mg²⁺,АТР-залежних катіон-транспортувальних електроензимів при вивченні однієї з нагальних проблем біохімії, біофізики та клітинної біології – з’ясуванні мембранних механізмів внутрішньоклітинної кальцієвої сигналізації. Наші результати, як ми вважаємо, також можуть бути корисними для  розбудови нових фармакологічних препаратів - нетоксичних низькомолекулярних високоафінних та селективних регуляторів функціональної активності катіон-транспортувальних електроензимів гладеньких м’язів. З урахуванням низької токсичності калікс[4]арену С-90 та його аналогів можна стверджувати, що вони є перспективними для клінічної практики у якості препаратів для підсилення окситоцин-стимульованих пологів під час їх ускладнень, а також для підвищення базального тонусу міометрія.