Телефонний довідник

Ukrainian English French German Italian Latvian Lithuanian Polish Spanish

Шановні колеги, вітаю Вас! Науковий семінар Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України «Актуальні проблеми сучасної біохімії» продовжує свою роботу. 6-го жовтня 2015 р. (вівторок) о 10-30 у Актовій залі Інституту відбудеться чергове засідання семінару. Будемо слухати доповідь пров. інж. лабораторії сигнальних механізмів клітини ІБХ НАНУ Базалія Андрія Вікторовича

«РОЛЬ АДАПТЕРНОГО ПРОТЕЇНУ Ruk/CIN85 У РЕЦЕПТОР-ЗАЛЕЖНИХ МЕХАНІЗМАХ АКТИВАЦІЇ NADPH-ОКСИДАЗИ І ВНУТРІШНЬОКЛІТИННОГО СИГНАЛЮВАННЯ У ПУХЛИННИХ КЛІТИНАХ». Мова йде за апробацію кандидатської дисертації. Як завжди, додаємо до цього листа файл із авторськими тезами доповіді. Запрошуємо Вас та Ваших колег до участі у роботі нашого семінару.

З повагою – С.О.Костерін

РОЛЬ АДАПТЕРНОГО ПРОТЕЇНУ Ruk/CIN85 У РЕЦЕПТОР-ЗАЛЕЖНИХ МЕХАНІЗМАХ АКТИВАЦІЇ NADPH-ОКСИДАЗИ І ВНУТРІШНЬОКЛІТИННОГО СИГНАЛЮВАННЯ У ПУХЛИННИХ КЛІТИНАХ

Базалій Андрій Вікторович

пров. інж. лабораторії сигнальних механізмів клітини

bazalii@biochem.kiev.ua

Актуальність теми. Зовнішній контроль проліферації, міграції й інвазії клітин здійснюють фактори росту, цитокіни і хемокіни шляхом активації рецептор-залежних внутрішньоклітинних сигнальних каскадів. Експериментальні дані останніх років свідчать, що рецептор-залежне утворення внутрішньоклітинного пероксиду водню – нового вторинного месенджера – не тільки забезпечує посилення і подовження активності рецептор-залежних сигнальних каскадів, але й пов’язане з міграцією та інвазією клітин. Ефекторними ензимами, залученими до продукування активних форм кисню, є представники родини мембранних NADPH-оксидаз. NADPH-оксидаза (НФ 1.6.99.6) або оксидаза дихального вибуху є ензимним комплексом, що локалізований на плазматичній мембрані. При відповідній активації NADPH-оксидаза використовує цитоплазматичний NADPH, електрони від якого через FAD і гем переносяться через мембрану на її зовнішній бік до кисню з утворенням супероксид-радикалу (О2·¯).

В роботі співробітників лабораторії сигнальних механізмів клітини Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України встановлено, що організатор NADPH-оксидазного комплексу протеїн Tks4 є зв’язувальним партнером адаптерного протеїну Ruk/CIN85, що дозволяє припустити участь останнього у регулюванні активності NADPH-оксидази й біологічних відповідей клітин. Наявні експериментальні дані свідчать, що Ruk/CIN85 бере участь в реалізації таких тривалих клітинних відповідей як везикулярний транспорт, ліганд-залежний ендоцитоз рецепторних тирозинових кіназ, проліферація, адгезія, міграція й інвазія пухлинних клітин. Ruk/CIN85 пов’язує комплекси тирозинкіназних рецепторів з головним регулятором їх ендоцитозу, убіквітинлігазою c-Cbl, а також з ендофілінами – ендосомними протеїнами, що забезпечують інвагінацію плазматичної мембрани на ранніх стадіях ендоцитозу. У злоякісно трансформованих клітинах ці рецептори уникають протеасомної деградації, що призводить до конститутивної активації сигнальних шляхів, які запускаються за їх участі. Припускається, що при цьому порушується взаємодія Ruk/CIN85 з Cbl, внаслідок чого Ruk/CIN85 накопичується у периферійних структурах, таких як фокальні контакти і ламеліподії, та внутрішньоклітинних мембранних структурахю

На сьогодні встановлено, що через окиснювальну модифікацію Н2О2 регулює активність ключових сигнальних ензимів таких як PKС, МАPК, РІ3K, фосфотирозинові фосфатази, РТЕN, рецепторні і цитоплазматичні тирозинові кінази та ін., що призводить до реорганізації актинового цитоскелету, адгезивних контактів і стимуляції міграції. Водночас, показана важлива роль у Н2О2-залежному сигналюванні тіоредоксин/тіоредоксин-редуктазної системи, відповідальної за відновлення окиснених протеїнів. Таким чином, наявні дані свідчать про те, що Н2О2-сигналювання за своїми закономірностями і біологічною значимістю є співставним з основними парадигмами, сформульованими для сигналювання, залежного від посттрансляційної модифікації клітинних протеїнів шляхом фосфорилювання. Однак, незважаючи на великий масив нагромаджених експериментальних даних, необхідні наступні дослідження, скеровані на з’ясування функціональної значимості локалізованої продукції Н2О2, механізмів рецептор-залежної активації NADPH-оксидаз і їх компартменталізації. Важливо також ідентифікувати нові мішені Н2О2 у редокс-залежних сигнальних подіях, таких як хемотаксис, проліферація, диференціювання, біологічне старіння та апоптоз.

Мета та завдання досліджень. Метою дослідження було дослідити можливу роль адаптерного протеїну Ruk/CIN85 у рецептор-залежних механізмах активації NADPH-оксидаз та внутрішньоклітинного сигналювання у пухлинних клітинах.

Для досягнення поставленої мети було сформульовано такі основні завдання:

  1. Порівняти продукування пероксиду водню клітинами з різним рівнем експресії адаптерного протеїну Ruk/CIN85.
  2. З’ясувати можливість співлокалізації адаптерного протеїну Ruk/CIN85 та продукування пероксиду водню у клітинах лінії MCF-7.
  3. Дослідити вплив інгібітора збирання NADPH-оксидазного комплексу апоциніну та пастки для АФК NAC на активацію ключових сигнальних молекул у відповідь на стимуляцію пухлинних клітин з різним рівнем експресії Ruk/CIN85 епідермальним фактором росту (EGF).
  4. Дослідити вплив апоциніну та NAC на проліферацію та міграцію клітин лінії MCF-7 з різним рівнем експресії адаптерного протеїну Ruk/CIN
  5. Проаналізувати рівень експресії ізоформ N у клітинах MCF-7 з різним вмістом Ruk/CIN
  6. Дослідити особливості взаємодії адаптерного протеїну Ruk/CIN85 та субодиниці-організатора NADPH-оксидаз Тks4 в пухлинних клітинах за допомогою реакції імунопреципітації та GSTinvitropull-down аналізу.

Методи дослідження: методи роботи з культурами клітин, трансфекція, лазерна конфокальна мікроскопія, електрофорез протеїнів в ПААГ та нуклеїнових кислот в агарозному гелі, Вестерн-блот аналіз, реакція імунопреципітації, методи молекулярного клонування, GST in vitro pull down аналіз.

Результати досліджень та їх наукова новизна. Вперше показано, що продукування АФК у пухлинних клітинах позитивно залежить від рівня експресії Ruk/CIN85: у субклонах клітин аденокарциноми грудної залози людини лінії MCF-7 з різним рівнем стабільної надекспресії повнорозмірної форми адаптерного протеїну, високоінвазивних клітинних лініях аденокарциноми грудної залози MDA-MВ 231 та аденокарциноми ободової кишки людини НТ-29. Пригнічення експресії Ruk/CIN85 за допомогою РНК-інтерференції з використанням лентивірусних конструкцій, що містять Ruk/CIN85-специфічні послідовності small hairpin RNA, продемонструвало значне зниження продукування АФК пухлинними клітинами, яке, в деяких випадках, практично не детектувалось. Виявлено також, що Ruk/CIN85-асоційоване продукування АФК є залежним від дії інгібітора збирання NADPH-оксидазного комплексу, апоциніну.

  Для з’ясування потенційної ролі Ruk/CIN85 у функціонуванні НАДФН-оксидазного комплексу і залежної від продукування Н2О2 реалізації довготривалих клітинних відповідей було поставлено завдання сконструювати плазмідні вектори для експресії в клітинах ссавців, що кодують внутрішньоклітинний біосенсор до пероксиду водню HyPer та злитий протеїн Ruk/CIN85-HyPer, з’ясувати його субклітинну локалізацію та здатність детектувати Н2О2. Встановлено, що у тимчасово трансфікованих клітинах HEK293 та MCF-7 Ruk/CIN85-HyPer концентрується у “dot”-подібних везикулярних структурах різних розмірів, тоді як HyPer розподілений у клітині дифузно. З використанням прижиттєвої флуоресцентної мікроскопії було продемонстровано зростання концентрації Н2О2 у репрезентативних везикулярних структурах протягом зазначеного часу експерименту. Таким чином, отримана генетична конструкція, що кодує химерний протеїн Ruk/CIN85-HyPer, може бути запропонована як новий інструмент для дослідження локалізованого продукування Н2О2 у живих клітинах.

Дослідженнями співробітників лабораторії сигнальних механізмів клітини раніше було показано, що підвищення експресії Ruk/CIN85 сприяє злоякісній трансформації клітин аденокарциноми грудної залози людини лінії MCF-7, зокрема впливає на рухливість, адгезивні властивості й інвазивність, ріст у напіврідкому агарі, забезпечує швидку і тривалу EGF-залежну активацію Erk1/2 та AktISrcкіназ. Нами вперше показано, що попередня обробка клітин MCF-7 субклону G10 з високим рівнем експресії Ruk/CIN85 апоциніном і N-ацетилцистеїном (NАС) призводить до реверсії тривалої активації Akt кінази на тимчасову з одночасним посиленням автофосфорилювання рецептора EGF. При цьому обробка клітин апоциніном супроводжувалась пригніченням їх міграції. Отримані дані дозволяють зробити висновок про існування регуляторного зв’язку між рівнем експресії досліджуваного адаптерного протеїну, інтенсивністю продукування АФК та особливостей його компартменталізації, динамікою активації сигналювання та біологічними відповідями пухлинних клітин.

         Для з’ясування можливих змін у рівні експресії генів, що кодують різні форми каталітичних субодиниць NADPH-оксидазного комплексу (Nox1, Nox2, Nox3, Nox4, Nox5, Duox2), залежно від рівня експресії Ruk/CIN85, було використано кількісну ПЛР у реальному часі. Показано, що в стабільних субклонах аденокарциномних клітин грудної залози людини лінії MCF-7 з різним рівнем експресії Ruk/CIN85 експресуються чотири гени – Nox1, Nox2, Nox5 та Duox2. Продемонстровано, що у клітинах субклонів із високим рівнем експресії Ruk/CIN85 (G4 і G10) значно більше утворюється мРНК Nox1 та Nox2, ніж у клітинах дикого типу та субклону D4 з низьким рівнем експресії Ruk/CIN85. Також спостерігалося значне зниження вмісту мРНК відповідних NADPH-оксидаз у клітинах G4, інфікованих shRNA-лентивірусом, специфічним до Ruk/CIN85. Водночас, рівень експресії мРНК Nox5, навпаки, знижується з підвищенням вмісту досліджуваного адаптерного протеїну. В клітинах субклону G4 з високим рівнем експресії адаптерного протеїну Ruk/CIN85 також відмічено значне зростання вмісту мРНК Duox2 порівняно з клітинами дикого типу, субклонів D4 і G10 та його зниження за умов siRNA інтерференції Ruk/CIN85. Одержані експериментальні дані свідчать про те, що підвищене продукування АФК в

клітинах MCF-7 із надекспресією адаптерного протеїну Ruk/CIN85 корелює з диференційними системними змінами у рівні експресії генів Nox.

Взаємодію Ruk/CIN85 з ендогенним протеїном Tks4, організатором NADPH-оксидазного комплексу, було підтверджено за допомогою реакції імунопреципітації та та детально проаналізовано за допомого GST in vitro pull down аналізу в лініях клітин різного тканинного походження. Також було досліджено динаміку даної взаємодії у клітинах лінії MCF-7 у відповідь на EGF, а також вплив апоциніну на вищевказаний процес.