Телефонний довідник

Ukrainian English French German Italian Latvian Lithuanian Polish Spanish

Шановні колеги, вітаю Вас! Після літніх відпусток науковий семінар Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України «Актуальні проблеми сучасної біохімії» продовжує свою роботу. 8-го вересня 2015 р. (вівторок) о 10-30 у Актовій залі Інституту відбудеться чергове 16-те (у поточному році) засідання семінару. Будемо слухати доповідь м.н.с. відділу молекулярної імунології ІБХ НАНУ Лабинцева Андрія Юрійовича «Молекулярні механізми реалізації рецептор-зв’язувальної та транспортної функції дифтерійного токсину». Мова йде за апробацію кандидатської дисертації. Як завжди, додаємо до цього листа файл із авторськими тезами доповіді. Запрошуємо Вас та Ваших колег до участі у роботі нашого семінару.

З повагою – С.О.Костерін.

Молекулярні механізми реалізації рецептор-зв’язувальної та транспортної функції дифтерійного токсину

Лабинцев Андрій Юрійович, м.н.с. відділу молекулярної імунології, lab.andrey@gmail.com

Актуальність. Дифтерійний токсин (ДТ) – протеїн, що складається з одного поліпептидного ланцюга довжиною у 535 амінокислотних залишків; структурно поділяється на три домени: R – рецептор-зв’язувальний, T – трансмембранний та C – каталітичний. R- та T-домени разом формують субодиницю В токсину. Кожен з доменів виконує важливу функцію у процесі клітинної інтоксикації дифтерійним токсином. R-домен взаємодіє зі специфічним рецептором proHB-EGF, така взаємодія викликає ендоцитоз комплексу токсин-рецептор всередину клітини у складі ендосоми. Зниження ендосомального рН призводить до активації Т-домену, входження його в ліпідний бішар мембрани та подальшої транслокації С-домену в цитозоль клітини. Після транслокації в цитозоль С-домен стає активним та каталізує реакцію модифікації еукаріотичного фактору елонгації 2. Накопичення модифікованих молекул фактору елонгації 2 призводить до зупинки біосинтезу протеїну і загибелі клітини.

ДТ, мабуть, найперший токсин бактеріального походження, який почав активно досліджуватися у світовому науковому товаристві. Про це свідчить велика кількість публікацій про будову, роль кожного з доменів, особливості синтезу та реалізації його токсичної функції. Виходячи з наявних на сьогодні даних, можливо стверджувати, що багато особливостей функціонування токсину залишилися без пояснення або є суперечливими: яким чином Т-домен входить в мембрану та транспортує С-домен, які ще білки здатен він транспортувати; в чому полягає нечутливість деяких видів ссавців до токсину, роль R-домену полягає лише у забезпеченні розпізнавання рецептора до токсину, чи він також важливий і для транспорту С-домену тощо. Незважаючи на недостатній ступінь дослідженості даних питань, вже зрозуміло, що ДТ може мати застосування і на практиці. Так, з широким розповсюдженням генетичної інженерії та технології химерних протеїнів, з’явилося розуміння, що токсин або його фрагменти можуть застосовуватися для створення імунотоксинів (високо специфічних протипухлинних ліків), систем специфічної доставки біомолекул крізь мембрану клітин, систем для високоефективного знищення лише певної міченої популяції клітин. Розкриття вищезгаданих питань, можливо, дозволить ще більше розширити спектр використання похідних токсину та підвищить ефективність використання вже існуючих.

Мета дослідження: визначення особливостей реалізації молекулярних механізмів рецептор-зв’язувальної та транспортної функції ДТ.

Завдання:

  1. Отримати та охарактеризувати рекомбінатні модельні протеїни, необхідні для дослідження рецептор-зв’язувальної та транспортної функції ДТ.
  2. Дослідити взаємодію фрагментів ДТ з клітинами чутливих та нечутливих до токсину видів тварин.
  3. Перевірити цитотоксичність субодиниці В ДТ.
  4. Визначити можливість впливу транспортного домену ДТ на внутрішньоклітинний транспорт токсину та на рН ендосомального середовища везикул з токсином.

Методи дослідження:біохімічні, імунологічні, кібернетичні, мікробіологічні, молекулярно-біологічні, оптичні, хімічні методи та методи роботи із культурою клітин еукаріот.

Результати: Результатом описаної роботи було створення нетоксичних похідних ДТ злитих з різноманітними флуоресцентними та рН-чутливими флуоресцентними протеїнами. Також було розроблено підходи до їх очистки та охарактеризовано їх функціональні властивості. Отримані похідні ДТ, необхідні для проведення більш детальних досліджень рецептор-зв’язувальної та транспортної функції токсину. Крім того, отримані флуоресцентні похідні токсину можуть бути використані і для визначення рівня експресії рецептора proHB-EGF з використанням флуоресцентних технік.

Показано здатність субодиниці В ДТ взаємодіяти з клітинами нечутливих до токсину видів тварин. Факт взаємодії радіоактивно міченого або біотинільованого ДТ з нечутливими до його дії клітинами був описаний в літературі, проте не був достатньо досліджений та не отримав чіткого пояснення. Вперше, з використанням рекомбінантного флуоресцентного похідного субодиниці ДТ та методів конфокальної мікроскопії, продемонстровано здатність ДТ проникати всередину клітин мишей, та вперше, з використанням методу протокової цитометрії, проаналізовано спорідненість флуоресцентного похідного ДТ до рецептора на поверхні чутливих та нечутливих до ДТ клітин.

В ході проведеної роботи було встановлено, що у високих концентраціях субодиниця В ДТ спричиняє цитотоксичний вплив на клітини гістоцитної лімфоми людини U937, як у вільному стані, так і у складі злитого протеїну ЕGFP-SubB. Цей вплив не був рецептор опосередкованим, проте, ймовірно, був пов'язаний з формуванням протонних каналів Т-доменом ДТ.

Вперше було показано вплив Т-домену на везикулярний транспорт ДТ. Згідно отриманих даних швидкість внутрішньоклітинного транспорту R-домену та субодиниці В різнилася, при чому субодиниця В, вірогідно, потрапляла в недосяжні для R-домену компартменти. В результаті досліду по колокалізації фрагментів ДТ з маркерами ендосомального шляху було продемонстровано відмінності в швидкості внутрішньоклітинного транспорту субодиниці В та R-домену, та, ймовірно, відмінності у певних етапах шляхів їх транспорту. Показано, що субодиниця В повільніше надходить до пізніх ендосом та лізосом. Також нами було підтверджено здатність Т-домену регулювати рН всередині ендосом з ДТ. Ймовірно, сформований Т-доменом канал здатен компенсувати роботу везикулярних протонних помп, що й виражається у підтримці сталого рівня ендосомального рН. Відомо, що більшість ендосомальних протеїназ проявляють активність у пізніх ендосомах та лізосомах при рН нижче 6, таким чином Т-домен може затримувати дозрівання ендосом шляхом стабілізації ендосомального рН на рівні 6,5, що буде сповільнювати перехід до пізніх ендосом та активацію ендосомальних протеїназ, підвищуючи тим самим ймовірність успішного транспортування C-домену ДТ до цитозолю.