Телефонний довідник

Ukrainian English French German Italian Latvian Lithuanian Polish Spanish

 ЛАБОРАТОРІЯ СИГНАЛЬНИХ МЕХАНІЗМІВ КЛІТИНИ

Завідувач – д.б.н., проф. ДРОБОТ Людмила Борисівна

Тел.: (044)234 39 22; E-mail: drobot@biochem.kiev.ua

Лабораторію як самостійну наукову структуру в межах інституту створено 2006 р.

У складі лабораторії працюють 1 старший науковий співробітник, 2 наукових співробітника, 1 молодший науковий співробітник, 2 провідних інженери, 1 інженер І категорії та 1 лаборант.

Основним напрямом досліджень лабораторії є з’ясування сигнальних механізмів, залучених до узгодженого контролю процесів проліферації, диференціювання та апоптозу нормальних і трансформованих клітин. Провідну роль у просторовому розмежуванні сигналювання відіграють адаптерні та риштувальні протеїни, які полегшують збирання протеїно-протеїнових комплексів та забезпечують їх взаємодії з елементами клітинних структур, регулюючи одночасно передавання сигналу в мережі. З клонуванням SH3-вмісного адаптерного протеїну Ruk/CIN85, що містить 3 SH3 домени, Pro- та Ser-збагачені послідовності та С-кінцеву "coiled-coil" ділянку, у 2000 році було започатковано (за участі керівника лабораторії) новий напрям досліджень у галузі клітинного сигналювання. Накопичені на сьогодні експериментальні дані свідчать про інтегруючу роль Ruk/CIN85 в регуляції архітектури актинового цитоскелету, міграції, інвазії й адгезії клітин, апоптозу, мітогенного сигналювання, ліганд-опосередкованованого ендоцитозу рецепторних тирозинових протеїнкіназ. Водночас, проблема подальшого вивчення механізмів, які лежать в основі реалізації біологічної активності Ruk/CIN85, залишається актуальною і потребує використання нових підходів до її розв’язання.

Найвагоміші результати за 2010–2015 р.р.

Попередні дані, отримані в лабораторії, продемонстрували значне підвищення експресії повнорозмірної форми адаптерного/риштувального протеїну Ruk/CIN85 у зразках гліобластом, меланом, аденокарцином матки та грудної залози людини. У звітний період в лабораторії було продовжено наукові дослідження, присвячені з’ясуванню біологічної ролі Ruk/CIN85 у канцерогенезі. З метою з’ясування впливу надекспресії Ruk/CIN85 на біологічні властивості пухлинних клітин були одержані та охарактеризовані стабільні трансфектанти клітин аденокарциноми грудної залози людини лінії MCF-7 та грудної залози миші лінії 4Т1, аденокарциноми легені людини лінії А549 та феохромоцитоми щура лінії РС12 з різним рівнем експресії рекомбінантних форм досліджуваного адаптерного протеїну (без молекулярної мітки та кон’югованих з зеленим флуоресцентним протеїном), сублінії клітин РС12 з тетрациклін-індукованою експресією повнорозмірної та середньої (без двох SH3AB доменів) форм Ruk/CIN85. В практику експериментальної роботи було також впроваджено метод пригнічення експресії гену Ruk/CIN85 за допомогою shRNA (smallhairpinRNA) та кількісну полімеразну ланцюгову реакцію у реальному часі, мишачі моделі канцерогенезу.

Результати проведених досліджень показали, що клітини клонів аденокарциноми грудної залози MCF-7 із стабільною надекспресією Rukl/CIN85 набувають фібробластоподібної морфології, характеризуються зниженням інтенсивності росту та адгезивності, підвищеними виживанням, колонієутворювальною здатністю, рухливістю та інвазивністю, конститутивною активацією транскрипційних факторів NFB, HIF-1α, посиленням продукції пероксиду водню, зниженням чутливості до дії естрогенів та TNFα., зміною відповіді на EGF. Так, продемонстровано, що EGF індукує швидшу, потужнішу і тривалішу активацію Erk1/2, Akt, та Src кіназ у порівнянні з клітинами MCF-7, які були трансфіковані вектором без вставки, тоді як інгібітори Src- й PI3K/Akt-залежних сигнальних шляхів повністю усувають Rukl/CIN85-опосередковані зміни у клітинній рухливості. Зроблено припущення про роль адаптерного протеїну Rukl/CIN85 в механізмах, що контролюють міграційний потенціал клітин раку грудної залози(Samoylenkoetal., 2012)..

Вперше показано, що в сублініях клітин MCF-7 зі стабільною надекспресією Ruk/CIN85 спостерігається зростання рівня продукції декількох компонентів системи активації плазміногену, а саме uPA, uPAR й РАІ-1. Отримані дані про здатність Ruk/CIN85 виявляти системні ефекти на транскрипційному рівні є цілком новими. Нами було також продемонстровано, що стимулювання експресії PAI-1 при дії Ruk/CIN85 залежить від наявності сайта відповіді на гіпоксію (HRE) в промоторі гену PAI-1. Більш того, як збільшення вмісту HIF-1α, так і посилення експресії PAI-1 не спостерігалися після пригнічення високих рівнів експресії Ruk/CIN85 з використанням методу РНК-інтерференції (Samoylenkoetal., 2010).

До оригінальних важливих результатів слід також віднести дані стосовно залучення Ruk/CIN85 до розвитку функціональних і молекулярних ознак, характерних для пухлинних стовбурових клітин. Зокрема, надекспресія Ruk/CIN85 у клітинах аденокарциноми грудної залози людини лінії MCF-7 веде до збільшення їх кількості у фазі клітинного циклу G0/G1, що корелює із зниженням проліферативного потенціалу, конститутивної активації Akt, Src і mTOR кіназ. В отриманих культурах зростає кількість живих суспензійних клітин, що свідчить про зниження їх адгезивних властивостей та зростання резистентності до аноїкісу. У субклонах з високим рівнем надекспресії адаптерного протеїну Ruk/CIN85 зростає розмір популяції клітин, які формують сфероїди та володіють здатністю до самовідтворення. Встановлено, що вміст CD44, розмір популяції клітин CD44+/CD24- та клітин, що погано фарбуються толуїдиновим синім, позитивно корелюють з рівнем експресії Ruk/CIN85. Продемонстровано, що надекспресія Ruk/CIN85 супроводжується підвищенням резистентності клітин MCF-7 до дії доксорубіцину, цисплатину, етопозиду та тамоксифену. Вперше показано, що надекспресія Ruk/CIN85 супроводжується зростанням активності ABC мембранних транспортерів та вмісту транспортеру типу ABCG2. Виявлено пряму залежність між активністю ензиму детоксикації АLDH та рівнем експресії Ruk/CIN85.

Встановлено також, що стабільні трансфектанти PC12/GFP-Ruk/CIN85 характеризуються тенденцією до формування кластерів і клонального росту, підвищенням здатності формувати сфероїди, тобто набувають фенотипу, характерного для клітин, що ініціюють розвиток злоякісних пухлин (СICs). Оригінальними є дані стосовно того, що у клітинах PC12 з надекспресією GFP-Ruk/CIN85 повністю блокується здатність до диференціювання за нейрональним типом, тоді як клітини дикого типу в середовищі з низьким вмістом сироватки після додавання NGF формують відростки, подібні до відростків нейронів симпатичної нервової системи. Виявлені особливості поведінки клітин PC12/GFP-Ruk/CIN85 корелюють з високим вмістом транскрипційного фактора Id1 (інгібітора диференціювання) та низьким транскрипційного фактора MATH2/NEUROD6 порівняно з контрольними mock-трансфікованими клітинами. Крім того, надекспресія Ruk/CIN85 призводить до конститутивної активації протеїнкінази В (Akt) та до посилення активації ERK1/2 при дії NGF, посилення проліферативного потенціалу клітин РС12 в повному середовищі і зміни швидкості проліферування за присутності епідермального фактора росту в середовищі з низьким вмістом сироватки, підвищення резистентності до токсичності, викликаної додаванням пероксиду водню.

Один із основних фрагментів проведених досліджень присвячений вивченню можливості й особливостей посттансляційної модифікації адаптерного протеїну Ruk/CIN85 шляхом фосфорилювання при дії на пухлинні клітини різноманітних регуляторних чинників та пошуку протеїнкіназ, здатних взаємодіяти з Ruk/CIN85 та модифікувати його. Продемонстровано, що досліджуваний протеїн фосфорилюється incelluloта виявлено зміни у рівні його фосфорилювання в процесі реалізації біологічних відповідей клітин. Зокрема, показано посилення фосфорилювання повнорозмірної форми Ruk/CIN85 при стимуляції клітин ембріональної нирки людини HEK293 сироваткою та інсуліном, тоді як за цих же умов фосфорилювання середньої ізоформи Rukm пригнічується. Виявлено диференційні зміни у рівні фосфорилювання досліджуваного протеїну за залишками Tyr, Ser і Thr в клітинах щурячої феохромоцитоми PC12 з тетрациклін-індукованою експресією досліджуваного адаптера при індукції їх проліферації та диференціаціювання EGF і NGF, відповідно. Вперше встановлено, що Ser/Thr-специфічна PKD є зв’язувальним партнером Ruk/CIN85, досліджено механізми міжмолекулярної взаємодії та ідентифіковано потенційні центри фосфорилювання. Продемонстровано пригнічення взаємодії Ruk/CIN85 з PKD2 при стимуляції В-клітинного рецептору в В-лімфоцитах, ізольованих з мигдаликів людини, та клітинах лімфоми Беркета Ramos та співлокалізацію досліджуваних сигнальних протеїнів в ділянках ламеліподій та мембранних складок в аденокарциномних клітинах грудної залози людини лінії MCF-7, стабільно трансфікованих Rukl/CIN85-GFP. Результати проведених досліджень дозволили припустити функціональну роль взаємодії Ruk/CIN85-PKD у регулюванні міграції й інвазії клітин.

Ідентифіковані також нові зв’язувальні партнери Ruk/CIN85, залучені до канцерогенезу, такі як адаптерні протеїни інтерсектин та Tks4, пролілгідроксилаза 2.

Результати проведених досліджень, що свідчать про важливу роль адаптерного протеїну Ruk/CIN85 у канцерогенезі, є пріоритетними, опубліковані у провідних фахових зарубіжних виданнях й можуть слугувати експериментальним базисом для розробки фармакологічних препаратів нового покоління, мішенями для яких стануть ключові центри організації сигнальних мереж клітин – адаптерні й риштувальні протеїни.

В рамках програмно-цільової та конкурсної тематики НАН України (програма «Нанотехнології та наноматеріали») продемонстровано протективний ефект фулеренів С60 на нормальні, але не трансформовані Т-клітини, за дії цитотоксичних агентів, а також специфічність апоптогенного ефекту фотозбуджених фулеренів С60 у пухлинних Т-клітинах. Результати проведених досліджень доводять перспективність застосування фулерена С60 для фотодинамічної терапії з метою вибіркової індукції апоптозу злоякісно трансформованих лімфоцитів та попередження загибелі нормальних клітин-попередників. Показано можливість використання фулерена С60 для посилення цитотоксичної дії цисплатину в чутливих до протипухлинного препарату лейкозних клітинах та для сенсибілізації резистентних до його дії клітин.

Міжнародна співпраця

У лабораторії налагоджено міжнародну співпрацю з такими науковими колективами:

  • Кардіффським університетом (Кардіфф, Велика Британія, професор Бухман В.Л.) Отримано дані стосовно змін у рівні експресії Ruk/CIN85 у зразках пухлин людини різного тканевого походження на рівні мРНК.
  • Медичною школою м. Ганновера (Німеччина), відділом нефрології (керівник відділу Доктор Маріо Шиффер). В рамках договору про співпрацю отримані дані, що свідчать про конкуренцію між адаптерними протеїнами CIN85/Ruk та CD2AP у зв’язуванні нефрину і подоцину, що, у свою чергу, забезпечує динамічний контроль стабільності і відновлення щільової діафрагми нирок.
  • Університетом Оулу, Фінляндія (співкерівник з фінського боку професор Томас Кітцман). В рамках договору про співпрацю отримані дані, що свідчать про потенційну роль Ruk/CIN85 у регулюванні PHD-залежного гідроксилювання залишків проліну в молекулі HIF-1α і, як наслідок, протеїнової стабільності транскрипційного фактору.
  • Інститутом експериментальної біології ім. Ненцького (Варшава, Польща, співкерівник з польського боку, завідувач лабораторії механізмів клітинної рухливості проф. Йоланта Редович). В рамках гранту про співробітництво між НАН України та Польською Академією Наук отримано дані про те, що адаптерний протеїн Tks4 є новим звязувальним партнером Ruk/CIN85.
  • Московським державним університетом ім. М.В. Ломоносова, факультетом експериментальної медицини (Москва, Росія, співкерівник з російського боку академік Ткачук В.А.) у рамках російсько-українських грантів між РФФД та НАН України 2010 та 2012 р.р. З використанням механізованої станції для прижиттєвої мікроскопії (Leica AF6000 LX) встановлено, що клітини MCF-7 з надекспресією Ruk/CIN85 характеризуються змінами в рухливості в порівнянні з клітинами «дикого типу», що посилюється за присутності урокінази. Здійснено субклонування кДНК Ruk/CIN85 у експресійний вектор, що кодує флуоресцентний протеїн- Hyper для детектування пероксиду водню всередині клітин. За допомогою прижиттєвої мікроскопії продемонстровано співлокалізацію продукування пероксиду водню та Ruk/CIN85 у внутрішньоклітинних везикулярних структурах клітин MCF-7.
  • Цюріхським університетом (Цюріх, Швейцарія, співкерівник зі Швейцарського боку Доктор Любор Борсіг). В рамках спільного проекту «c-MybandRuk/CIN85 modulatethesignalinginbreastcancertherebyaffectingmetastasis», підтриманого Національною Науковою Фундацією Швейцарії (Проект SCOPESIZ73Z, продемонстровано, що аденокарциномні клітини грудної залози миші лінії 4Т1 з надекспресією Ruk/CIN85 характеризуються підвищеною здатністю до трансендотеліальної міграції та посиленням інвазивного потенціалу.
  • Університетом Східної Кароліни (TheBrodySchoolofMedicine, DepartmentofMicrobiologyandImmunology, керівник відділу Dr. JamesA. McCubrey) в рамках спільного гранту між НАН України та УНТЦ-2013 (грант №5974 «Отримання стабільних ліній пухлинних клітин, що експресують ознаки CSCs, для розробки та моніторингу ефективності нових протипухлинних препаратів»).

Найважливіші публікації співробітників лабораторії за 2010–2015 рр.

  1. SamoylenkoA., DimovaE.Y., KozlovaN., DrobotL., KietzmannT. TheadaptorproteinRuk/CIN85 activatesplasminogenactivatorinhibitor-1 (PAI-1) expressionviahypoxia-induciblefactor-1alpha // Thromb. Haemost.2010. – Vol. 103, №5.P. 901-909.
  2. Tossidou I., Teng B., Drobot L., Meyer-Schwesinger C., Worthmann K., Haller H., Schiffer M. CIN85/RukL is a novel binding partner of nephrin and podocin and mediates slit diaphragm turnover in podocytes // J. Biol. Chem. -2010. – Vol. 285, 33. – P. 25285-25295.
  3. Dimova E.Y., Samoylenko A., Kietzmann T. FOXO4 induces human plasminogen activator inhibitor-1 gene expression via an indirect mechanism by modulating HIF-1alpha and CREB levels // Antioxid. Redox. Signal. – 2010. – Vol. 13, № 4. – P. 413-424.
  4. Самойленко А. А. Роль протеїнів родини HIF (hypoxia-inducible factor) в регулюванні фізіологічних відповідей клітин на гіпоксію // Укр. біохім. журнал – 2010. – Т. 82, № 4. – С. 5-17.
  5. PalyvodaK.O., GrynyukI.I., PrylutskaS.V.,SamoylenkoA.A., DrobotL.B., MatyshevskaO.P. ApoptosisphotoinductionbyC60fullereneinhumanleukemicT cells // Укр. біохім. журнал – 2010. – Том. 82, № 4. – С. 121-127.
  6. Steelman LS, Navolanic P, Chappell WH, Abrams SL, Wong EW, Martelli AM, Cocco L, Stivala F, Libra M, Nicoletti F, Drobot LB, Franklin RA, McCubrey JA. Involvement of Akt and mTOR in chemotherapeutic- and hormonal-based drug resistance and response to radiation in breast cancer cells // Cell Cycle.- 2011.- Vol.10, №17.- Р. 3003-3015.
  7. SokoloskyML, StadelmanKM, Chappell WH, AbramsSL, MartelliAM, Stivala F, LibraM, NicolettiF, Drobot LB, FranklinRA, SteelmanLS, McCubrey JA. Involvement of Akt-1 and mTOR in sensitivity of breast cancer to targeted therapy // Oncotarget.- 2011.- Vol. 2, № 7.- P. 538-550.
  8. DergaiM, SkrypkinaI, Dergai O, TsybaL, NovokhatskaO, FilonenkoV, Drobot L, RynditchA. IdentificationandcharacterizationofanovelmammalianisoformoftheendocyticadaptorITSN1 // Gene.- 2011.- Vol. 485, № 2.- P. 120-129.
  9. Самойленко А.А. Підвищення експресії адаптерного протеїну Ruk/CIN85 в клітинах аденокарциноми грудної залози людини MCF-7 при дії інсуліну та інсуліноподібного фактора росту-1 // Доповіді НАН України - 2011. – № 4. – С. 158-162.
  10. M. Grebinyk, K. O. Palyvoda, S. V. Prylutska, I. I. Grynyuk, A. A. Samoylenko, L. B. Drobot, O. P. Matyshevska. Photoactivated fullerene C60 induces store-operated Ca2+ entry and cytochrome c release in Jurkat cells //Укр. Біохім. Журнал. - 2012. - Т.84, № 6. С.58-63.
  11. SamoylenkoA, Vynnytska-MyronovskaB, BytsN, KozlovaN, BasarabaO, PasichnykG, PalyvodaK, BobakY, BarskaM, MayevskaO, RzhepetskyY, ShuvayevaH, LyzogubovV, UsenkoV, SavranV, VolodkoN, BuchmanV, KietzmannT, DrobotL. Increased levels of the HER1 adaptor protein Rukl/CIN85 contribute to breast cancer malignancy // Carcinogenesis.- 2012.- Vol. 33, № 10.- P. 1976-1984.
  12. Самойленко А.А., Биць Н.В., Пасічник Г.В., Козлова Н.В., Базалій А.В., Геращенко Д.С., Шандренко С.Г., Воротніков О.В., Кітцманн Т., Комісаренко С.В., Дробот Л.Б. Відповідь пухлинних клітин на пригнічення експресії адаптерного протеїну Ruk/CIN85 рекомбінантними лентивірусами // Biotechnologia Acta. – 2013. – Т.6, №4. – С. 182-189.
  13. Пасічник Г.В., Поворознюк О.О., Горак І.Р., Геращенко Д.С., Пономаренко О.В., Самойленко А.А., Биць Н.В., Дробот Л.Б. Надекспресія адаптерного протеїну Rukl/CIN85 у аденокарциномних клітинах молочної залози людини лінії MCF-7 супроводжується підвищенням їх хіміорезистентності // Доповіді НАН України – 2013. - №12. – С. 149-156.
  14. DrobotL.B., SamoylenkoA.A., VorotnikovA.V., Tyurin-KuzminP.A., BazaliiA.A., KietzmannT., TkachukV.A., KomisarenkoS.V. Reactiveoxygenspeciesin signaltransduction // Укр. Біохім. Журн. – 2013. – T. 85, №6. – с. 208-216.
  15. Davis N. M., Sokolosky M., Stadelman K., Abrams S. L., Libra M., Candido S., Nicoletti F., Polesel J., Maestro R., D'Assoro A., Drobot L., Rakus D., Gizak A., Laidler P., Dulińska-Litewka J., Basecke J, Mijatovic S., Maksimovic-Ivanic D., Montalto G., Cervello M., Fitzgerald T L., Demidenko Z., Martelli A. M., Cocco L., Steelman L. S., McCubrey J. A. Deregulation of the EGFR/PI3K/PTEN/Akt/mTORC1 pathway in breast cancer: possibilities for therapeutic intervention // Oncotarget. – 2014. – V. 5, № 13. – P. 4603-4650.
  16. Vynnytska-Myronovska B., Bobak Ya., Pasichnyk H., Igumentseva N., Samoylenko A., Drobot L. Multiple molecular forms of adaptor protein Ruk/CIN85 are specifically associated with different subcellular compartments in human breast adenocarcinoma MCF-7 cells // Ukr. Biochem. J. – 2014. – V. 86, №5. – P. 103-111.
  17. BazaliiA. V., SamoylenkoA. A., PetukhovD. M., RynditchA. V., RedowiczM.-J., DrobotL. B. InteractionbetweenadaptorproteinsRuk/CIN85 andTks4 innormalandtumorcells // BiopolymersandCell. – 2014. – V. 30, N1. – P. 33-37.
  1. Матышевская О.П., Паливода К.О., Прилуцкая С.В, Гринюк И.И., Пасечник А.В., Петухов Д.Н., Дробот Л.Б. Индукция апоптической гибели лейкемических клеток с использованием фуллерена С60. Наноразмерные системы и наноматериалы: исследования в Украине. Академпериодика. – Киев. - 2014. С. 524-529.
  1. ChiT. F., JensenJ. K., KozlovaN., SamoylenkoA., KietzmannT. PAI-1 modulatescellmigrationinaLRP1-dependentmannerviaβ-cateninandERK1/2 // ThrombosisandHaemostasis. – 2015. – V. 113, N5. – P. 988-998.
  2. KozlovaN., SamoylenkoA., DrobotL., KietzmannT. UrokinaseisanegativemodulatorofEGF-dependentproliferationandmotilityinthetwobreastcancercelllinesMCF-7 andMDA-MB-231 // Mol.Carcinog., 2015. Jan 15. doi: 10.1002/mc.22267. [Epub ahead of print].

Підготовка кадрів

Протягом 2010-2015 р.р. у лабораторії захищено 3 та підготовлено до захисту 2 кандидатські дисертації, захищено 1 докторську дисертацію. Захищено 6 бакалаврських та 7 магістерських робіт